姜鳳全 楊春 陳陣

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011；2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116011

膀胱腫瘤組織及尿液標(biāo)本中TWIST1基因的甲基化水平研究

姜鳳全1 楊春2 陳陣1

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011；2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116011

背景與目的：眾多遺傳學(xué)及表觀遺傳性的改變引發(fā)癌基因的激活劑抑癌基因的失活是膀胱腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，本研究旨在揭示膀胱腫瘤患者腫瘤組織及尿液標(biāo)本TWIST1基因的甲基化模式。方法：78例經(jīng)病理確診的膀胱腫瘤標(biāo)本、癌旁正常組織及配對(duì)75例尿液標(biāo)本組成實(shí)驗(yàn)組，75例年齡及性別比例匹配的非腫瘤個(gè)體組成對(duì)照組。從腫瘤、癌旁及尿液標(biāo)本提取DNA，甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)檢測(cè)腫瘤組織、癌旁組織及尿液標(biāo)本中TWIST1基因的甲基化水平，檢測(cè)結(jié)果與尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度及特異度。結(jié)果：甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示，88.5%的腫瘤標(biāo)本及84.0%的尿液標(biāo)本出現(xiàn)TWIST1基因的甲基化，11.5%的癌旁正常組織及5.3%的對(duì)照尿液標(biāo)本出現(xiàn)甲基化。尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，49.3%的腫瘤患者尿液標(biāo)本檢測(cè)出瘤細(xì)胞，17.3%的對(duì)照者被診斷為腫瘤或疑似腫瘤。尿液標(biāo)本甲基化檢測(cè)靈敏度及特異度顯著高于尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法。針對(duì)低級(jí)別腫瘤，TWIST1基因甲基化檢測(cè)靈敏度為66.7%，高于尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(33.3%)。結(jié)論：TWIST1基因甲基化水平檢測(cè)可作為一種簡(jiǎn)單、非侵入、敏感及特異的方法應(yīng)用于早期膀胱腫瘤診斷篩查。

TWIST1基因；膀胱腫瘤；尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)；甲基化

膀胱腫瘤是世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第5位的惡性腫瘤，在泌尿生殖系腫瘤致死率居第2位。膀胱腫瘤診斷方法中，作為金標(biāo)準(zhǔn)的膀胱鏡檢查具有最高的敏感性，但其不足之處在于費(fèi)用較高，作為有創(chuàng)檢查會(huì)給患者帶來(lái)不同程度的不適感［1］。非侵入性檢查中，尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)一直在臨床上廣泛使用，但該檢測(cè)方法存在靈敏度低，尤其是針對(duì)低級(jí)別移行細(xì)胞癌。多數(shù)細(xì)胞基礎(chǔ)的檢測(cè)方法因靈敏度及特異度的欠缺無(wú)法在臨床推廣。

TWIST1是堿性的螺旋-環(huán)-螺旋(basic helixloop-helix，bHLH)蛋白家族中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其mRNA在胎盤(pán)組織表達(dá)量最高，在胚胎發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。TWIST1參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transitions, EMTs)過(guò)程的調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［2］。轉(zhuǎn)移性腫瘤中常見(jiàn)TWIST1過(guò)表達(dá)或啟動(dòng)子的甲基化。目前國(guó)內(nèi)外涉及膀胱腫瘤與TWIST1基因的相關(guān)性研究包括，TWIST1蛋白表達(dá)與腫瘤的相關(guān)性分析，以及尿液標(biāo)本甲基化水平檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)TWIST1基因作為一種癌基因在膀胱腫瘤中其mRNA低表達(dá)，而TWIST1蛋白則相對(duì)正常組織呈現(xiàn)高表達(dá)［3-4］，腫瘤患者尿液樣本TWIST1基因甲基化水平顯著高于正常對(duì)照者［5］。本研究采用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)TWIST1基因在膀胱腫瘤組織、癌旁正常組織和尿液標(biāo)本中的甲基化水平，擬闡明此檢測(cè)技術(shù)在膀胱腫瘤早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

2009年12月—2012年8月我院診治的膀胱尿路上皮癌患者78例，男性55例，女性23例，年齡28～83歲，中位年齡59歲。腫瘤組織取自手術(shù)切除膀胱組織，參照WHO/ISUP (2010)標(biāo)準(zhǔn)行腫瘤分級(jí)，參照TNM(2010)(Edge等［6］)行臨床分期。Ta期為非侵襲性乳頭狀瘤，T1期腫瘤侵及皮下結(jié)締組織，T2期侵及肌層，T3期侵透膀胱壁，T4期腫瘤合并其他臟器如前列腺，輸尿管、陰道或腹壁。

將78例經(jīng)病理確診的膀胱腫瘤標(biāo)本、癌旁正常組織及配對(duì)的75例尿液標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，另采集75例健康體檢者尿液標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男性53例，女性22例；年齡32～79歲，中位年齡57歲(表1)。所有受試對(duì)象均知情同意，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。

表1 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組臨床資料Tab. 1 Clinical characteristics data of study group and control group (n)

1.2 DNA提取

術(shù)中所取腫瘤標(biāo)本于-80 ℃冰箱保存，DNA提取試劑盒使用Invitrogen公司PureLinkTM基因組DNA提取試劑盒，尿液標(biāo)本DNA提取應(yīng)用Zymo Research公司ZR尿液DNA提取試劑盒。提取的DNA標(biāo)本于-20 ℃冰箱保存。

1.3 甲基化特異性PCR(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP) 檢測(cè)

EZ DNA甲基化修飾試劑盒(Zymo Research公司)，亞硫酸氫鹽修飾的通用人類(lèi)甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)(Bisul fi te Converted Universal Methylated Human DNA Standard)(Zymo Research 美國(guó))用作陽(yáng)性對(duì)照，以經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的人外周血淋巴細(xì)胞DNA作為甲基化陰性對(duì)照。

亞硫酸氫鹽修飾D N A樣本，因?yàn)槟蛞篋 N A樣本量的限制，每次修飾使用約200 ng DNA樣本，而腫瘤標(biāo)本，每次使用約500 ng DNA用于甲基化修飾。MSP特異引物序列TWIST1-M順義鏈：5’-TTTCGGATGGG GTTGTTATC-3’，反義鏈：5’-AAACGACC TAACCCGAACG-3’；TWIST1-U順義鏈：5’-TTTGGATGGGGTTGTTATTGT-3’；反義鏈：5’-CCTAACCCAAACAACCAACC-3’。甲基化反應(yīng)體系50 μL，2 μL修飾的DNA模板，每種dNTP濃度均0.25 mmol/L，每種引物濃度均為0.5 μmol/L，2單位Taq聚合酶。反應(yīng)過(guò)程：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸60 s，共計(jì)40循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，TWIST1基因甲基化和非甲基化產(chǎn)物分別200 bp和193 bp，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。每例樣品設(shè)3個(gè)對(duì)照：甲基化陽(yáng)性、陰性對(duì)照以及水作為空白對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤標(biāo)本甲基化率

78例膀胱腫瘤標(biāo)本，TWIST1甲基化率為88.5%(69/78)，癌旁組織為11.5%(9/78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，甲基化狀態(tài)與腫瘤的分期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.231，圖1，表2)。此外，甲基化狀態(tài)與腫瘤復(fù)發(fā)以及吸煙與否也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.843，P=0.426)。

圖1 腫瘤組織標(biāo)本及尿液標(biāo)本TWIST1基因甲基化檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 TWIST1 gene MS-PCR detection results for tumor and urine sample

表2 腫瘤及尿液標(biāo)本甲基化率檢測(cè)結(jié)果Tab. 2 Methylation frequency results of tumor and urine samples [n(%)]

2.2 尿液標(biāo)本甲基化水平檢測(cè)

75例膀胱癌患者尿液標(biāo)本TWIST1甲基化率靈敏度為84.0%(63/75)，特異度為94.7(71/75)。對(duì)照組的尿液標(biāo)本TWIST1甲基化率為5.3%，配對(duì)尿液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示，腫瘤標(biāo)本出現(xiàn)甲基化的患者尿液標(biāo)本中才可檢測(cè)出甲基化，沒(méi)有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)(圖1)。

對(duì)比尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果，75例患者尿液標(biāo)本中，37例診斷為腫瘤或可疑，診斷靈敏度為49.3%(37/75)，特異度為82.7%(62/75)。對(duì)照組尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，有13(17.3%)診斷為腫瘤或可疑。尿液標(biāo)本甲基化檢測(cè)靈敏度及特異度顯著高于尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。針對(duì)低級(jí)別腫瘤，TWIST1基因甲基化檢測(cè)靈敏度為66.7%(6/9)，高于尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的33.3%(3/9)。

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及一系列遺傳學(xué)改變，包括染色體畸形、癌基因突變或擴(kuò)增激活以及抑癌基因的失活等。內(nèi)環(huán)境大量微效基因的協(xié)同調(diào)節(jié)以及外環(huán)境的影響組成了惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制［7］。

TWIST1基因定位于染色體7p21.2，編碼蛋白起到轉(zhuǎn)錄因子的作用，可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育工程中的細(xì)胞重建，因同時(shí)具備EMT調(diào)節(jié)功能，研究發(fā)現(xiàn)TWIST1能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)TWIST1基因表達(dá)情況的異常以及啟動(dòng)子區(qū)超甲基化的出現(xiàn)［8-10］。

膀胱腫瘤是泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居泌尿生殖系腫瘤第2位。膀胱腫瘤具有易復(fù)發(fā)的特性，早期篩查，早期診斷對(duì)有效預(yù)防腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)及獲得更好的預(yù)后有重要幫助。臨床上采用的傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)有著敏感性及特異性不高的缺陷，而金標(biāo)準(zhǔn)的膀胱鏡檢查又存在費(fèi)用高，侵入性給患者帶來(lái)不適等缺點(diǎn)。尋找新的分子診斷靶點(diǎn)以及安全非侵入性的診斷技術(shù)成為膀胱腫瘤診斷中的突破點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)TWIST1基因甲基化水平與膀胱腫瘤診斷技術(shù)相關(guān)性方面文獻(xiàn)少見(jiàn)報(bào)道，研究對(duì)象限于尿液標(biāo)本。

本研究中我們分析了膀胱腫瘤患者腫瘤組織及尿液標(biāo)本中TWIST1基因甲基化模式。尿液標(biāo)本中尿路上皮脫落細(xì)胞可用于DNA的檢測(cè)，為泌尿系統(tǒng)腫瘤的診斷提供了便利。研究發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤組織及配對(duì)尿液標(biāo)本中TWIST1基因的甲基化率非常高，分別達(dá)到了88.5%和84.0%，對(duì)照組尿液標(biāo)本中甲基化率僅為5.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示甲基化與腫瘤的分期等臨床參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性。本研究尿液標(biāo)本甲基化檢測(cè)結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本相一致，腫瘤的分期分級(jí)結(jié)構(gòu)不同以及檢驗(yàn)方法的不同可能在一定程度上影響檢測(cè)結(jié)果，與之前研究結(jié)果稍有不同［5］。

惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與EMT密切相關(guān)，TWIST1調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制在于細(xì)胞上皮標(biāo)志如E-鈣粘連蛋白的失去，而獲得間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志，即EMT過(guò)程。此過(guò)程使得腫瘤組織能脫離原發(fā)灶向周?chē)M織波及，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了基礎(chǔ)。乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌及食管癌等多種惡性腫瘤中均存在E-鈣粘連蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏附功能的減弱［9］，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

甲基化這一重要的表觀遺傳學(xué)改變，能在不改變遺傳物質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱腫瘤形成過(guò)程中涉及多種基因甲基化水平的改變，TWIST1甲基化狀態(tài)的改變能影響EMT的進(jìn)程，從而影響腫瘤的侵襲力及復(fù)發(fā)特性。

本研究結(jié)果提示，尿液標(biāo)本甲基化水平檢測(cè)對(duì)比尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)有著更高的靈敏度和特異度。進(jìn)一步的研究需要證實(shí)甲基化與基因表達(dá)的可能關(guān)系，通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道，超甲基化應(yīng)導(dǎo)致基因表達(dá)的下調(diào)。存在的問(wèn)題就是，TWIST1作為癌基因，應(yīng)該在腫瘤組織中高表達(dá)，而這與其超甲基化水平相矛盾。Christoph等［11］及Navarro等［12］的研究結(jié)果提示，DNA的甲基化水平并非完全與基因的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)。在乳腺癌、結(jié)直腸癌的研究結(jié)果也提示，TWIST1基因的甲基化水平與基因表達(dá)未表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能影響著基因的表達(dá)［13-14］。Tang等［3］報(bào)道TWIST1在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，而mRNA 水平較正常組織顯著降低，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的存在，接下來(lái)的研究重點(diǎn)將圍繞表達(dá)調(diào)控，揭示甲基化、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多方面機(jī)制在TWIST1基因表達(dá)中的作用。

綜上所述，TWIST1基因可作為膀胱腫瘤的一個(gè)候選檢測(cè)靶點(diǎn)，甲基化水平的檢測(cè)的高靈敏度及特異度提示其可作為安全無(wú)創(chuàng)的膀胱腫瘤篩查方法，尤其是針對(duì)低分期腫瘤。

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Hypermethylation of TWIST1 gene in tumor tissues and voided urine in bladder cancer patients

JIANG Feng-quan1, YANG Chun2, CHEN Zhen1(1. Laboratory Department, The First Af fi liated Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116011, China; 2. Nuclear Medicine Department, The First Af fi liated Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116011, China)

CHEN Zhen E-mail: zhenchen6@126.com

Background and purpose:Accumulation of genetic and epigenetic changes that lead to the activation of proto-oncogenes or inactivation of tumor suppressor genes play important roles in development and progression of bladder cancer. We aimed to investigate the methylation patterns of TWIST1 gene in bladder cancer.Methods:A total number of 78 histologically con fi rmed bladder tumor samples and paired 75 urine samples constituted the study group and was compared with 75 age-matched and gender-matched non-cancerous individuals. DNA was puri fi ed from both tumor, adjacent tissues and urine samples. The methylation status of the TWIST1 gene was analyzed by methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) in both urinary bladder cell carcinoma samples, adjacent tissues and urine samples. Sensitivity and speci fi city values of the method were assessed and compared with the results of the cytology test.Results:Methylation of TWIST1 was detected in 88.5% of carcinoma samples and 84% of the paired urine samples，respectively; 11.5% carcinoma adjacent tissues and 5.3% control urine sample was methylated. The sensitivity by urine cytology detection method was 49.3% in in bladder cancer patients, and was 17.3% in control group. The sensitivity of TWIST1 genes was 66.7% for low-grade cases. The sensitivity of urine cytology was 33.3% for the same low-grade cases.Conclusion:The methylation analysis of TWIST1 gene may be a simple, non-invasive, sensitive, and speci fi c method for early detecting bladder cancer cells in urine.

TWIST1; Bladder tumor; Cytology test; Methylation

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.03.001

R737.14

A

1007-3639(2014)03-0161-05

2014-01-02

2014-02-18）

遼寧省科技廳基金項(xiàng)目(No: 2013225021)。

陳陣 E-mail:zhenchen6@126.com