李全輝 紀志鵬 葛運飛 丁印魯 山東大學第二醫(yī)院普外科 濟南 250033

肝臟缺血再灌注（HIR）是普外科臨床常見的創(chuàng)傷后及肝臟手術后的病理生理過程，可導致嚴重的肝臟損傷，其具體損傷機制可能與氧化應激及炎癥反應等途徑有關[1-4]。三七，又名田七，是五加科人參屬草本植物，其主要藥理活性成分為三七總皂苷（panaxnonginsengsaponins，PNS），研究[5]表明其在神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等組織器官缺血再灌注損傷或其他損傷中均具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。本研究利用大鼠肝缺血再灌注損傷模型，觀察氧化應激及炎癥相關指標變化，探討三七總皂苷對肝臟缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Spraque Dawley大鼠30只，體質量250～300g，購于山東大學實驗動物中心。動物飼養(yǎng)合格證號：SCXK（魯）20030004。術前予以自由進食飲水、恒溫恒濕等規(guī)范化飼養(yǎng)。

1.2 實驗試劑 三七總皂苷（粉劑，純度99%，純昆明植物研究所），MDA、SOD檢測試劑盒（南京凱基生物公司），MPO、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、ELISA 檢測試劑盒（武漢博士德公司）。

1.3 動物分組及動物模型制備 30只大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、肝缺血再灌注組（HIR組）和三七總皂苷治療組（PNS組），每組10只。三組均于術前禁食12h，戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉，參照Pringle法[6]構建肝缺血再灌注模型，Sham組僅暴露肝動脈、門靜脈、膽管等肝門結構但不夾閉阻斷，術后120min處死；HIR組及PNS組則夾閉肝門結構30min，開放再灌注180min后處死。PNS組術前1h予50mg/kg的PNS生理鹽水溶液（濃度5mg/mL）腹腔注射，Sham組及HIR組則均于術前1h給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射。預處理3h后處死大鼠。

1.4 檢測指標 ①丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定：應用比色法測定大鼠缺血再灌注損傷后肝組織MDA含量以確定脂質過氧化水平，進而評估氧化應激水平。MDA在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）反應生成紅棕色的三甲川（3，5，5-三甲基惡唑-2，4二酮），最大吸收波長532nm。取大鼠肝臟組織100mg加入2mL PPS 50mmol/L液制成勻漿，超聲粉碎10s×3次，根據MDA檢測試劑盒說明操作，于分光光度計中計算MDA濃度。②超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測：肝組織勻漿SOD活性應用專用試劑盒測定，SOD活性單位以引起50%O2-歧化的酶含量表示。③髓過氧化物酶（MPO）檢測：前述肝組織勻漿，應用MPO檢測試劑盒檢測，1U的MPO活力以25℃時1min分解H2O21mmol表示（U/g）。④炎癥相關因子測定：血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）及肝組織中細胞間黏附因子-1（ICAM-1）含量均應用ELISA法檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，將檢驗各組數據均符合正態(tài)分布，予單因素方差分析，其中方差齊性者，組間行SNK檢驗，方差不齊者，組間行Dunnett’s T3檢驗，P＜0.05顯示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 三組氧化應激相關指標比較 肝缺血再灌注損傷組（HIR組）MDA水平較假手術組（Sham組）明顯升高（P＜0.05），而 SOD 活性則明顯下降（P＜0.05），三七總皂苷治療組（PNS組）MDA水平較HIR組明顯下降（P＜0.05），且 SOD 活性明顯上升（P＜0.05），但與Sham組比較差異仍有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

2.2 三組炎癥相關指標比較 HIR組肝組織中MPO活性、ICAM-1及血清TNF-α、IL-1β含量均較Sham組明顯升高（P＜0.05）,而PNS組肝組織中MPO活性、ICAM-1及血清TNF-α、IL-1β含量雖較Sham組有顯著升高（P＜0.05），但較HIR組明顯下降（P＜0.05），見表 2、圖 2～3。

表1 三組大鼠肝組織氧化應激及內源性抗氧化指標比較

圖1 三組大鼠肝缺血再灌注損傷后肝組織MDA及SOD變化注：Sham組：假手術組；H IR組：肝缺血再灌注損傷組；PNS組：三七總皂苷治療組；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

表2 三組大鼠肝組織及血清炎癥相關指標比較

圖2 三組大鼠肝缺血再灌注損傷后肝組織MPO、ICAM-1變化注：Sham組：假手術組；HIR組：肝缺血再灌注損傷組；PNS組：三七總皂苷治療組

3 討 論

圖3 三組大鼠肝缺血再灌注損傷后

肝臟缺血再灌注損傷可以導致不同程度肝細胞腫脹、空泡變性，是一個復雜的病理生理過程，常見于肝臟外科手術、肝移植手術、低血容量性休克、肝靜脈閉塞病、Budd-Chiari綜合征等疾病及移植前的器官冷保存[7-9]。肝臟缺血再灌注損傷可導致肝代謝、解毒功能降低、循環(huán)阻力升高，乃至肝功能衰竭，進而影響患者預后。多種機制參與肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程，自由基引發(fā)的氧化應激可以導致肝臟氧化及抗氧化調節(jié)失去平衡，是肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要機制。已有研究表明，丙二醛（MDA）是生物體內自由基作用于脂質發(fā)生脂質過氧化的終產物，其含量水平可間接顯示氧自由基對于機體細胞受攻擊的程度[10]，而超氧化物歧化酶（SOD）活性則反映了體內內源性抗氧化體系的功能，其可催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，平衡體內氧自由基[11]。本研究表明缺血再灌注后肝組織MDA水平明顯升高（P＜0.05），內源性SOD活性則明顯下降（P＜0.05），進一步證實了氧化應激及內源性抗氧化體系失衡在缺血再灌注肝組織損傷中起重要作用，而PNS治療后，雖然無法完全扭轉這一失衡的趨勢，但可以一定程度上減輕體內氧化應激及內源性抗氧化體系不平衡程度，進而表明，PNS可以通過減輕氧自由基損傷并改善內源性抗氧化體系功能來減輕肝組織缺血再灌注損傷。

此外，多種炎癥相關因子的釋放也參與了肝缺血再灌注損傷的病理生理過程。研究表明肝缺血再灌注損傷過程中導致缺血組織中性粒細胞黏附及遷移。在與內皮細胞交互作用下，結合黏附分子，中性粒細胞聚集可導致肝血竇阻塞、細胞毒性物質釋放、Kuffer細胞激活等組織變化，進而引發(fā)肝組織損傷[12]。髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細胞組織浸潤程度的指標，已有研究及本實驗均證實，缺血再灌注后肝組織MPO活性明顯升高。ICAM-1參與中性粒細胞與內皮細胞之間黏附，是重要的黏附因子。TNF-α來源于巨噬細胞分泌，可以促進中性粒細胞在組織中的浸潤，是重要的炎癥介質。而IL-1β作為另一重要的致炎細胞因子可以誘導間質細胞分泌炎癥相關蛋白酶（如MMP），并激活T細胞，參與組織炎癥過程。TNF-α與IL-1β可以刺激組織ICAM-1表達，進而增加中性粒細胞浸潤，加重組織損傷。本研究選取TNF-α、IL-1β、ICAM-1 作為 HIR 后炎癥反應的主要指標，也證實缺血再灌注后肝組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1均有不同程度升高，進而表明炎癥反應與肝組織參缺血再灌注損傷的過程，與已有相關研究報道相符[2，12-14]。

三七總皂苷（PNS）為傳統(tǒng)中藥三七的主要活性成分，研究[5]證實，其在心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等組織器官中具有多種生理作用，具體藥理機制與改善缺氧、降血糖、降血脂、改善微循環(huán)、抗氧化、抗炎、抗衰老等相關。研究[5]也表明，抗氧自由基損傷、減輕鈣超載、抗炎等途徑是其減輕肝組織缺血再灌注損傷的主要方式。本研究顯示PNS治療可以明顯降低缺血再灌注后肝組織中MDA水平、MPO活性、ICAM-1含量及血清TNF-α、IL-1β，并明顯升高SOD活性（P＜0.05）。實驗結果表明PNS可以通過抑制脂質過氧化并增強內源性抗氧化體系功能而減少肝缺血再灌注后氧化應激損傷，也可通過影響炎癥介質釋放及中性粒細胞浸潤而減輕HIR損傷。

綜上所述，三七總皂苷可以通過減少氧化應激水平以及炎癥因子表達進而減輕肝缺血再灌注損傷，起肝臟保護作用，具有廣泛的臨床應用前景。

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