周榮幸 程南生 李富宇

近年來(lái)文獻(xiàn)顯示，醫(yī)源性膽管損傷的發(fā)生概率依然有0.74%～2%[1-3]。此外，肝內(nèi)膽管結(jié)石或膽總管結(jié)石常年結(jié)石刺激會(huì)對(duì)膽管壁造成透壁性炎性損傷，肝內(nèi)膽管結(jié)石病例中由此發(fā)生的肝門(mén)膽管狹窄甚至膽管壁部分缺失在亞太地區(qū)也并非罕見(jiàn)。由于膽管自身修復(fù)能力較差，其修復(fù)完全靠纖維瘢痕組織愈合完成，目前的治療方法有限，臨床治療現(xiàn)有的球囊擴(kuò)張、膽管支架、膽管端端吻合以及膽腸吻合術(shù)等手術(shù)方案，療效遠(yuǎn)不令人滿意[2-6]，尚需探討新的治療途徑。尋找更為優(yōu)良的具備膽管正常組織結(jié)構(gòu)和功能的膽管替代物是當(dāng)今肝膽外科所急需解決的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)生物組織工程學(xué)以及高分子材料學(xué)的研究進(jìn)展，利用豬膽管、輸尿管等組織材料已經(jīng)制作脫細(xì)胞管腔基質(zhì)材料，并在材料腔內(nèi)面復(fù)合高分子聚氨酯(PU)材料后成功制備人工仿真膽管，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)，證實(shí)該材料在體外的生物力學(xué)特性、免疫原性、細(xì)胞毒性以及在體內(nèi)的降解性等特性能滿足體內(nèi)實(shí)驗(yàn)要求[7]，進(jìn)一步行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，檢驗(yàn)其在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)于膽管狹窄或者缺損的修復(fù)效果，為遠(yuǎn)期臨床實(shí)際應(yīng)用做先期探索性準(zhǔn)備。

材料與方法

一、人工仿真膽管的制備[7]

采用健康封閉群內(nèi)江成年豬膽管以及輸尿管組織；剪除管腔周圍結(jié)締組織后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中攪拌清洗2 h，1%十二烷基硫酸鈉(SDS)液浸泡攪拌24 h，PBS反復(fù)沖洗3～4次，取出1% Triton-100(聚乙二醇單辛基苯基醚)浸泡攪拌24 h；烘干機(jī)37℃烘24 h，干燥的脫細(xì)胞支架內(nèi)均勻涂抹濃度為10%的聚氨酯水乳液，控制管壁厚度0.2～0.4 mm；烘干機(jī)37℃干燥72 h，密封包裝，γ射線滅菌，完成人工仿真膽管的制備(圖1)。

二、人工膽管治療膽管缺損動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

將購(gòu)于四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的18只封閉群內(nèi)江豬隨機(jī)分為三組，每組各6只。①支架組：植入手術(shù)時(shí)切除距離胰腺上端1 cm膽總管約1 cm，應(yīng)用人工仿真膽管原位端端吻合修復(fù)缺損的膽管，同時(shí)于管腔內(nèi)安置硅膠支架。②無(wú)支架組：植入的人工膽管腔內(nèi)不安置塑料支架，其余均同支架組。③假手術(shù)組：開(kāi)腹后直接關(guān)腹。植入手術(shù)時(shí)取右側(cè)肋緣下切口進(jìn)腹，打開(kāi)肝十二指腸韌帶腹膜，分離出膽總管；從膽囊管和肝總管匯合處下方1 cm處剪斷膽總管約1 cm；取人工仿真膽管，修剪長(zhǎng)度約1.5 cm，支架材料內(nèi)徑約0.3～0.5 cm，支架組安置一硅膠支架，長(zhǎng)度約2 cm，直徑0.3 cm，管壁厚度0.03 cm，分別越過(guò)上下吻合口約1 cm；6-0 Prolene線連續(xù)縫合上下端吻合口。

三、血清學(xué)檢查

術(shù)后第1、3、7、30、60、90天采集血液樣本送四川大學(xué)華西醫(yī)院生化室檢測(cè)血常規(guī)、肝臟功能、腎臟功能，并使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血清白細(xì)胞介素6(IL-6)水平。

四、組織標(biāo)本采集及觀察

分別于植入術(shù)后第15、30、70、100天處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡后，取樣從肝門(mén)部至十二指腸段膽管分3段(從下至上，第一段是植入段近端膽管，第二段是植入段，第三段為植入段遠(yuǎn)端膽管)切斷并予以石蠟包埋后切片，切片行常規(guī)HE染色、細(xì)胞角蛋白19(CK19)和上皮細(xì)胞黏附分子(HEA125)免疫熒光染色。

A.制備的人工仿真膽管;B.脫細(xì)胞支架的熒光染色;C.內(nèi)面附著聚氨酯后的熒光染色圖1 成功制備的人工仿真膽管

五、CK19、HEA125的免疫組化檢測(cè)

按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化熒光染色，主要流程包括：切片脫蠟后滴加一抗，在4℃反應(yīng)過(guò)夜后滴加二抗，最后在室溫下顯色，于激光共聚焦平臺(tái)采集圖像。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS(19.0版)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。連續(xù)性變量采取t或者U檢驗(yàn)，二分類變量采取卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、動(dòng)物體內(nèi)重建

每一臺(tái)動(dòng)物手術(shù)均由同一位主刀醫(yī)生完成，如圖2所示，吻合后人工仿真膽管充盈，膽汁引流通暢，術(shù)野無(wú)漏膽。

圖2 吻合完成 圖示吻合完成后人工仿真膽管充盈,術(shù)野未見(jiàn)漏膽

二、實(shí)驗(yàn)室檢查

各組動(dòng)物植入術(shù)后血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素水平(TB)、IL-6、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)結(jié)果變化曲線見(jiàn)圖3。支架組、假手術(shù)組植入術(shù)后血清TB未見(jiàn)明顯升高，WBC在術(shù)后輕度升高，術(shù)后第1周后逐漸下降到正常值；無(wú)支架組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清TB呈進(jìn)行性升高趨勢(shì)，ALT、WBC、IL-6不同程度升高。支架組、無(wú)支架組術(shù)中膽管膽汁細(xì)菌培養(yǎng)均未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，無(wú)支架組動(dòng)物死亡后有2只動(dòng)物膽管膽汁細(xì)菌培養(yǎng)出大腸桿菌，支架組、假手術(shù)組處死后膽汁細(xì)菌培養(yǎng)未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

三、大體標(biāo)本

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死或者死亡后解剖均未見(jiàn)膽漏。無(wú)支架組植入術(shù)后第2、7、8天死亡的動(dòng)物解剖發(fā)現(xiàn)腹腔粘連明顯，肝臟不同程度淤膽，膽管周圍組織水腫，大網(wǎng)膜包裹肝外膽管，肝內(nèi)外膽管以及膽囊明顯擴(kuò)張(植入術(shù)后第2天死亡輕度擴(kuò)張)，吻合口狹窄、吻合口遠(yuǎn)端膽管無(wú)擴(kuò)張，膿性膽汁，黏稠，大量絮狀物；第40天死亡的動(dòng)物解剖發(fā)現(xiàn)肝臟纖維化，肝內(nèi)外膽管擴(kuò)張，膽汁黏稠，結(jié)石形成，吻合口下方膽管成束裝，攣縮(圖4)。支架組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于第15、30、70、100天處死，解剖發(fā)現(xiàn)支架組動(dòng)物肝內(nèi)外膽管未見(jiàn)明顯擴(kuò)張，膽汁顏色金黃，無(wú)絮狀物以及結(jié)石形成，吻合口無(wú)明顯狹窄，但可見(jiàn)6-0 Prolene縫線殘留，植入膽管腔無(wú)塌陷(圖5、6)。假手術(shù)組動(dòng)物解剖和正常組織無(wú)明顯差別。

四、人工仿真膽管植入術(shù)后病理學(xué)改變

1．支架組HE染色結(jié)果 植入術(shù)后第15天無(wú)顯上皮以及黏膜下腺體生長(zhǎng)，植入段近端可見(jiàn)黏膜輕度增生，遠(yuǎn)端黏膜下腺體豐富，上皮增生(圖7A～C)；植入術(shù)后第30天植入段上皮開(kāi)始形成，伴有黏膜下腺體的增生，植入段近端膽管黏膜輕度增生，遠(yuǎn)端上皮、黏膜下腺體增生明顯(圖7D～F)；植入術(shù)后第70天復(fù)層增生上皮覆蓋新生膽管，黏膜下腺體增生更為明顯，近端和遠(yuǎn)端膽管的黏膜均較植入術(shù)后第30天增生明顯(圖7G～I(xiàn))；植入術(shù)后第100天可見(jiàn)新生膽管被膽管類似上皮完整覆蓋，黏膜下腺體略有減少，近端及遠(yuǎn)端膽管黏膜及黏膜下腺體較植入術(shù)后第70天增生減退(圖7J～L)。

圖3 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后血清ALT、TB、IL-6、WBC的變化曲線

A.膽管、膽囊擴(kuò)張明顯,肝臟淤膽改變(植入術(shù)后第8天);B.膽管下端纖維化,攣縮,狹窄(植入術(shù)后第8天);C.肝臟纖維化改變,形態(tài)失常,可見(jiàn)結(jié)石形成,肝外膽管纖維條索化改變(植入術(shù)后第40天)圖4 無(wú)支架組動(dòng)物死亡后解剖圖

植入術(shù)后第100天動(dòng)物解剖可見(jiàn)肝臟顏色正常,肝內(nèi)外膽管無(wú)擴(kuò)張,剖開(kāi)膽管未見(jiàn)狹窄,可見(jiàn)支架材料以及縫線殘留圖5 支架組動(dòng)物解剖后標(biāo)本

A.植入術(shù)后第15天;B.植入術(shù)后第30天;C.植入術(shù)后第70天;D.植入術(shù)后第100天圖6 支架組動(dòng)物處死后膽管標(biāo)本取材

明

2．無(wú)支架組動(dòng)物標(biāo)本 HE染色可見(jiàn)，植入術(shù)后可見(jiàn)上皮水腫，黏膜下層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，人工仿真膽管可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；植入術(shù)后40天死亡動(dòng)物可見(jiàn)結(jié)構(gòu)混亂，無(wú)明顯黏膜、黏膜下層次，未見(jiàn)管腔結(jié)構(gòu)(圖8)。

3．假手術(shù)組動(dòng)物標(biāo)本 此組膽管未見(jiàn)異常。

五、CK19和HEA125免疫熒光染色

為了判定植入段膽管覆膜組織的來(lái)源，我們進(jìn)行了膽管上皮組織定性的CK19以及HEA125的免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果提示，在人工仿真膽管植入后，新生膽管在形成的過(guò)程中，伴隨有上皮細(xì)胞、黏膜下腺體的形成和增生。在支架組植入術(shù)后第15天，與植入段近、遠(yuǎn)端正常膽管黏膜上皮相比，人工仿真膽管植入段未見(jiàn)明顯CK19和HEA125表達(dá)，提示無(wú)明顯上皮及黏膜下腺體形成；植入術(shù)后第30天，人工仿真膽管植入段有少量CK19和HEA125表達(dá)，提示有上皮及黏膜下腺體開(kāi)始形成；植入術(shù)后第70天，人工仿真膽管植入段可見(jiàn)有較多的CK19和HEA125表達(dá)，提示類似膽管上皮和黏膜下腺體樣組織增生明顯；植入術(shù)后第100天，人工仿真膽管植入段的CK19和HEA125表達(dá)與植入段近、遠(yuǎn)端正常膽管黏膜上皮的CK19和HEA125表達(dá)相接近，提示在人工仿真膽管管腔內(nèi)形成更為完整的類似于膽管上皮樣組織，但黏膜下CK19和HEA125表達(dá)較第70天明顯減少(圖9、10)。

討 論

膽管缺損和狹窄性疾病的治療至今仍是肝膽外科學(xué)的難點(diǎn)，目前尚無(wú)滿意的治療方案[1-6]。盡管目前已有利用胃竇肌瓣、小腸肌瓣、肝圓韌帶組織進(jìn)行原位修復(fù)的一些術(shù)式，但大多數(shù)術(shù)后狹窄率高，術(shù)后遠(yuǎn)期效果遠(yuǎn)不令人滿意。盡管目前大多數(shù)學(xué)者主張?jiān)恍迯?fù)[4,6]，保留Oddi括約肌的功能，但鑒于目前原位修復(fù)對(duì)病例要求較高，僅少數(shù)病例可實(shí)施，多數(shù)此類病人不得不因膽管缺損較大而接受膽腸吻合術(shù)，這種手術(shù)方式的并發(fā)癥包括反流性膽管炎、膽管再次狹窄、膽管結(jié)石、膽汁性肝硬化等，而這些并發(fā)癥的處理難度大、效果差，常需實(shí)施多次外科手術(shù)或內(nèi)鏡治療，給病人帶來(lái)極大的身心痛苦，并為病人家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8-9]。因此，如果能尋找能有效修復(fù)膽管缺損或狹窄的替代材料進(jìn)行原位修復(fù)，就能避免膽腸吻合術(shù)所帶來(lái)的一系列弊端，為膽管缺損性和狹窄性疾病的治療開(kāi)辟全新的治療途徑。

A～C為植入術(shù)后第15天;D～F為植入術(shù)后第30天;G～I(xiàn)為植入術(shù)后第70天;J～L為植入術(shù)后第100天A、D、G、J為植入段近端膽管;B、E、H、K為植入段膽管;C、F、I、L植入段遠(yuǎn)端膽管圖7 支架組植入人工仿真膽管的術(shù)后改變(HE染色,×200)

A.植入術(shù)后第7天可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),上皮細(xì)胞水腫(HE,×200);B.植入術(shù)后第7天可見(jiàn)人工仿真膽管炎性細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜面水腫(HE,×200);C.植入術(shù)后第40天鏡下可見(jiàn)結(jié)構(gòu)混亂,無(wú)明顯黏膜、黏膜下腺體結(jié)構(gòu),無(wú)管腔結(jié)構(gòu)(HE,×400)圖8 無(wú)支架組動(dòng)物死亡后植入段遠(yuǎn)端膽管HE染色

肝外膽管缺乏足夠的肌層[10]，其損傷或缺損后主要靠纖維結(jié)締組織修復(fù)的特性決定了膽管較其他管腔結(jié)構(gòu)更易發(fā)生纖維化、狹窄。鑒于人工血管目前已成功地應(yīng)用于臨床治療[11]，人工膽管亦可能成為膽管缺損性疾病和狹窄性疾病的替代性修復(fù)材料。但目前人工膽管仍面臨無(wú)有效的表面組織覆膜、免疫原性較強(qiáng)易誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)、易炎性狹窄，無(wú)法真正替代膽管功能等問(wèn)題[12-13]。而本實(shí)驗(yàn)初步探討了應(yīng)用人工仿真膽管修復(fù)體內(nèi)膽管缺損的實(shí)驗(yàn)療效，研究結(jié)果表明，在保留膽總管下端Oddi括約肌功能的基礎(chǔ)上，植入的脫細(xì)胞基質(zhì)人工膽管可很好地維持膽管腔的完整性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中膽管無(wú)梗阻、無(wú)漏膽發(fā)生，再生后的膽管組織能較好地起到替代正常膽管引流膽汁的生理功能的作用，因此人工仿真膽管有可能為膽管狹窄及缺損性病變的治療提供一個(gè)潛在性全新的治療選擇。對(duì)于膽管狹窄、閉鎖、腫瘤等疾病，以往大多只能選擇膽-腸吻合這樣的手段來(lái)解決。也許在不久的將來(lái)，肝膽外科醫(yī)生可以在切除病灶的基礎(chǔ)上選擇人工膽管植入進(jìn)行原位修復(fù)，保留了Oddi括約肌的功能，有效防止膽腸吻合帶來(lái)的一系列并發(fā)癥，大大提高該類病人的術(shù)后遠(yuǎn)期療效和生活質(zhì)量。

眾所周知，為了維持膽管正常生理功能，膽管上皮細(xì)胞扮演了重要的角色。盡管膽管上皮細(xì)胞僅占肝細(xì)胞的3%～5%，然而其卻在膽汁流經(jīng)膽管時(shí)調(diào)整膽汁成分中發(fā)揮了重要的功能[14]，膽管上皮形成的黏膜還可以阻礙膽汁滲入黏膜下層，避免刺激纖維層的成纖維細(xì)胞活化增殖形成瘢痕。CK-19和HEA-125大多存在于膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等上皮樣來(lái)源的細(xì)胞當(dāng)中，是迄今為止較為公認(rèn)的膽管上皮細(xì)胞相對(duì)特異性的標(biāo)記物[15-16]。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同階段植入段膽管CK19、HEA125的動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果顯示，在人工仿真膽管植入后，新生膽管在形成的過(guò)程中，伴隨有上皮細(xì)胞、黏膜下腺體的形成和增生。隨著植入時(shí)間的延長(zhǎng)，人工仿真膽管植入段的CK19和HEA125表達(dá)與與植入段近、遠(yuǎn)端膽管黏膜上皮的CK19和HEA125表達(dá)愈相接近，提示在人工仿真膽管管腔內(nèi)逐步形成較為完整的膽管上皮樣組織。膽管上皮的成功再生可能得益于較低的炎性反應(yīng)[9, 17]，以及與人工仿真膽管的多孔海綿樣組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，多孔的結(jié)構(gòu)讓上皮細(xì)胞易于穿透和附著。盡管和正常膽管的單層柱狀上皮略有不同，其原因可能是因此局部細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、支架刺激以及膽鹽的綜合因素結(jié)果所致。但CK19、HEA125的免疫熒光結(jié)果提示人工仿真膽管覆膜組織來(lái)源與正常膽管黏膜上皮相類似，其遠(yuǎn)期能否形成與正常膽管上皮完全一致的上皮組織有待于后期進(jìn)一步觀察證實(shí)。在此需著重指出的是，我們構(gòu)建的人工仿真膽管表面的覆膜組織無(wú)論是否是真正的膽管上皮組織，其能很好的維持膽管缺損修復(fù)處的完整性，并保護(hù)黏膜下的纖維肌層免被膽汁侵蝕。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)管腔塌陷，無(wú)吻合口狹窄、無(wú)梗阻性黃疸，無(wú)膽汁滲漏，無(wú)膽汁性腹膜炎，膽管引流通暢；可以很好的行使正常的膽管膽汁引流功能，能夠較好的達(dá)到膽管缺損的修復(fù)、重建、人工植入物替代功能。

為了維持良好的膽管引流功能，重中之重的是如何有效避免膽管狹窄。人工仿真膽管植入后所導(dǎo)致的炎癥同膽管狹窄密切相關(guān)。眾所周知，在有感染、創(chuàng)傷、免疫排斥等因素的刺激下，多種細(xì)胞會(huì)釋放IL-6并觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)IL-6的分泌[18]，促使炎癥局部范圍以及血清中IL-6濃度的上升。IL-6在急性炎癥中，可以誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞合成和分泌急性期蛋白、促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖、以及中性粒細(xì)胞的激活和定向分化，在炎癥中扮演了重要的角色[19-20]。而過(guò)度的刺激炎癥細(xì)胞會(huì)大量釋放TGF-β1[21]，活化成纖維細(xì)胞核肌成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增生、新生血管形成，刺激巨噬細(xì)胞分泌過(guò)量的彈力纖維和纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致瘢痕形成、攣縮引發(fā)膽管狹窄。因此，IL-6是一種重要的炎性介質(zhì)，其水平同炎癥程度密切相關(guān)[22]。為此，我們前期通過(guò)α-gal抗原的免疫組化檢測(cè)了人工仿真膽管的免疫原性較低[7]。α-gal抗原是一種廣泛存在多種細(xì)胞中的自然抗原，并且是人體內(nèi)最大的抗體簇，其IgM以及IgG亞型抗體同植入排斥相關(guān)[23]。人工仿真膽管的免疫原性相關(guān)研究結(jié)果表明α-gal呈低表達(dá)；結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，支架組的血清IL-6水平在1周內(nèi)較假手術(shù)組輕度升高，1周后血清IL-6水平同假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以及支架組動(dòng)物處死后膽汁無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，WBC在植入術(shù)后第7天后逐漸恢復(fù)正常范圍，而且組織學(xué)提示局部炎性細(xì)胞較少，這些結(jié)果提示支架組的炎性反應(yīng)較低，遠(yuǎn)期再狹窄可能性較低。

本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)支架組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均死亡，解剖發(fā)現(xiàn)肝外膽管擴(kuò)張明顯、膽汁淤積，考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死于急性梗阻性化膿性膽管炎。解剖發(fā)現(xiàn)梗阻層面均位于植入段，而術(shù)中人工仿真膽管吻合后可見(jiàn)其充盈良好，梗阻原因是由于手術(shù)縫合導(dǎo)致閉塞的可能性小，由于人工仿真膽管材質(zhì)較軟，容易塌陷，且膽管內(nèi)壓力較低，膽管狹窄或閉塞可能是術(shù)后膽管周圍組織水腫壓迫所致。同樣也有其他學(xué)者報(bào)道采用脫細(xì)胞基質(zhì)材料在膽管植入術(shù)后容易萎縮和塌陷而導(dǎo)致膽管梗阻的報(bào)道[9-17]。本實(shí)驗(yàn)采用了內(nèi)置膽管支撐是基于對(duì)人工仿真膽管材料的生物力學(xué)特性以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特點(diǎn)而考慮的。人工仿真膽管材質(zhì)偏軟，在植入后容易狹窄，盡管內(nèi)面涂抹了10%PU可以加強(qiáng)其生物力學(xué)強(qiáng)度，但是在體內(nèi)重建實(shí)驗(yàn)中仍會(huì)塌陷，而置入了支架后可以幫助其維持管腔結(jié)構(gòu)，且實(shí)驗(yàn)證明沒(méi)有影響膽管的重塑和膽管上皮的移行。并且，支架膽管吻合口愈合過(guò)程中能起到持續(xù)性的局部加壓作用，而加壓治療是預(yù)防和治療瘢痕增生的重要方法之一[24]。持續(xù)性適當(dāng)?shù)募訅嚎墒柜：垩芮蛔兗?xì)，血管數(shù)量下降，瘢痕中血供減少，且能使血管壁內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生退變，加重?fù)p傷血管壁，導(dǎo)致瘢痕組織缺血缺氧，組織缺氧導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞發(fā)生退行性變，釋放溶酶體可水解膠原結(jié)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)沉積減少；另外細(xì)胞內(nèi)缺氧會(huì)導(dǎo)致線粒體水腫，功能減退或者停滯，成纖維細(xì)胞增殖受阻，膠原及細(xì)胞外基質(zhì)生成能力減弱，抑制瘢痕形成[25-26]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，人工仿真膽管植入術(shù)中，于膽管內(nèi)安置支架的方案被證實(shí)是必要的。后續(xù)研究中，擬將該支架作為膽管塑形過(guò)程中的過(guò)渡性支撐，待膽管塑形完成后，可拔出該支架，盡管就目前而言，對(duì)于支架支撐的時(shí)間長(zhǎng)短尚無(wú)定論。

本實(shí)驗(yàn)證明了脫細(xì)胞支架制作的人工仿真膽管有著以下特性：基本可完全降解以及可接受的降解速度、低局部炎癥反應(yīng)及低免疫原性，低細(xì)胞毒性等；動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)管腔塌陷、吻合口狹窄、膽漏、膽管狹窄等并發(fā)癥發(fā)生，很好地行使了膽管引流膽汁的功能，證明其有潛力成為一種較為理想的生物材料應(yīng)用于臨床膽管缺損的替代修補(bǔ)材料。但是就目前而言，要將其應(yīng)用于臨床之前，還有很多的需改進(jìn)和進(jìn)一步研究之處。首先，本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為正常的膽管組織，而臨床應(yīng)用往往是針對(duì)那些有病變的膽管組織，對(duì)于這樣的體內(nèi)環(huán)境，膽管重建修復(fù)的結(jié)果是否與本實(shí)驗(yàn)一致還有待于進(jìn)一步探討；其次，該人工仿真膽管材料的生物力學(xué)強(qiáng)度不夠，不能完全維持自身管腔結(jié)構(gòu)，尚需安置膽管支架，對(duì)此世界范圍尚無(wú)一個(gè)很好的解決辦法，據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果推測(cè)，在人工仿真膽管的塑形期，安置支架是有必要的，后續(xù)研究中，可將該支架作為臨時(shí)支架，待塑形完成之后，可拔出該類支架；此外，此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間最長(zhǎng)100 d，缺乏新生膽管的遠(yuǎn)期效果評(píng)價(jià)；最后，本實(shí)驗(yàn)人工仿真膽管植入長(zhǎng)度為1 cm，雖然結(jié)果較為滿意，但1 cm的長(zhǎng)度遠(yuǎn)不足滿足未來(lái)臨床需要，對(duì)需要使用長(zhǎng)度更長(zhǎng)的人工仿真膽管材料才能完成的膽管重建的情況下，其結(jié)果還無(wú)法預(yù)測(cè)。目前人工膽管的研究，還僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，雖能較好保持膽管腔完整性以及維持膽管功能，但還有諸多需要進(jìn)一步研究之處，不過(guò)鑒于人工血管已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床，我們有理由相信，通過(guò)學(xué)者不斷的提高和改進(jìn)，人工膽管也有成功應(yīng)用臨床的一天。

(本文圖9見(jiàn)封二，圖10見(jiàn)目次Ⅳ)

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