（農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（成都）四川省飼料工作總站，四川成都610041）

霉菌毒素是霉菌的次生代謝產(chǎn)物，是霉菌生長所導致的一個重要結(jié)果。部分霉菌毒素毒性強，致病能力強，危害大。長期以來人們錯誤地認為霉菌毒素問題多見于南方梅雨季節(jié)或夏季高溫高濕時間。而最近幾年的研究表明，霉菌毒素對動物的危害是全國性、全年性的，霉菌可以在不同地區(qū)、不同溫度范圍內(nèi)繁殖產(chǎn)生。以霉菌毒素中最常見的黃曲霉毒素為例，黃曲霉毒素屬于遺傳毒性致癌物(致DNA損傷)，也是目前發(fā)現(xiàn)的化學致癌物中最強的物質(zhì)之一。1993年，世界衛(wèi)生組織和國際癌癥研究所將黃曲霉毒素確定為一級人類致癌物。飼料中霉菌毒素對人體的危害由此可見，建立一種經(jīng)濟、快捷、準確度和靈敏度高的檢測方法很有必要。與應永飛等的霉菌毒素檢測方法相比,本文建立的我國有限量標準的幾種霉菌毒素檢測方法有以下創(chuàng)新點：①采用新開發(fā)的MycoSpin?400多功能柱對樣品進行凈化，減少了分析過程中對目標物的干擾。②同時檢測5種霉菌毒素，所有我國現(xiàn)在飼料中有限量標準的霉菌毒素均可以同時檢測。③正、負離子同時檢測，節(jié)約了檢測時間和成本，提高了檢測效率。④采用13C內(nèi)標定量，幾種我國有限量標準的霉菌毒素均采用自己的同位素內(nèi)標，檢測結(jié)果更加科學、準確。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀配有電噴霧源(美國Aglient 1290/6460)；電子天平(0.01 mg，德國賽多利斯公司);渦旋振蕩器（禾本森科有限公司）；電動振蕩器（美國LKA-werke公司）；高速冷凍離心機（Biofug PrimoR公司）；N-EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；乙酸、乙酸銨（優(yōu)級純，天津科密歐化學試劑公司）；MycoSpin?400多功能凈化柱(美國Romer公司)；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混標：1.0 μg/ml(美國Romer公司);嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素混標：10 μg/ml(美國Romer公司)；赭曲霉毒素A:10 μg/ml(美國Romer公司)。黃曲霉毒素B1([13C17]-aflatoxin B1)、嘔吐毒素([13C15]-deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮([13C18]-zearale?none)、T-2毒素([13C24]-T-2 toxin)和赭曲霉毒素A([13C20]-ochratoxin A)同位素內(nèi)標(美國Romer公司)。實驗用水為超純水機(美國MILLPORE公司)純化的超純水。

1.2 色譜和質(zhì)譜條件

Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱（2.1 mm×100 mm,2.4 μm,美國賽默飛世爾科技公司）；柱溫：35℃；進樣體積：5 μl；流速：300 μl/min；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

離子源：電噴霧離子源；檢測方式：多反應監(jiān)測；毛細管電壓：正模式4 000 V，負模式3 500 V；干燥氣溫度：350℃;干燥氣流量：13 L/min；霧化氣壓力40 psi；掃描方式、監(jiān)測離子對(m/z)和其他參考條件參見表2。

名稱嘔吐毒素[13C15]-deoxynivalenol黃曲霉毒素G2黃曲霉毒素G1黃曲霉毒素B2黃曲霉毒素B1[13C17]-aflatoxin B1赭曲霉毒素A[13C20]-ochratoxin A T-2毒素[13C24]-T-2 toxin玉米赤霉烯酮[13C18]-zearalenone保留時間(min)2.11 2.11 3.88 4.13 4.36 4.59 4.59 5.58 5.58 5.98 5.98 6.36 6.36母離子(Fm)297.1（85）312.2(88)331.0(100)329.1(140)315.1(110)313.1(130)330.1(140)404.0(109)424.1(108)484.3(94)508.1(84)317.1(148)335.2(152)定量離子(CE)249.1（6）263.2(4)313.1(25)243.1(29)287.1(29)285.1(21)301.2(19)239.0(21)250.1(19)305.2(3)322.3(3)175.2(21)290.3(11)定性離子(CE)203.1（14）285.1(29)283.0(25)259.1(29)241.1(40)358.1(9)185.2(12)131.2(25)

1.3 溶液配制

準確移取適量標準溶液儲備液，用10 mM乙酸銨-甲醇(8：2，V/V)稀釋，配制成100、80、50、20、10和5 ng/ml混合標準工作液，置于冰箱中2~8℃保存，有效期3個月。提取液：乙腈：水(84：16,V/V)。

1.4 樣品處理步驟

準確稱取經(jīng)粉碎過40目篩，0.45 mm孔徑的飼料樣品5 g試樣(精確至0.001 g)于50 ml離心管中，加入25 ml提取液（84/16，乙腈/水溶液），再加入0.25 ml乙酸，渦旋均質(zhì)3 min或者振蕩90 min，過濾上清液，或10 000 r/min離心5 min，將1 ml過濾后的上清液和適當內(nèi)標液加入MycoSpin?400凈化柱中，蓋緊凈化柱，劇烈振蕩混合1 min，掰斷凈化柱底端，將凈化柱放入離心管中，以10 000 r/min離心3 min，蒸干500 μl上清液，用500 μl流動相定容，過0.22 μm濾膜，上LCMS/MS檢測。

1.5 定性測定

進行樣品測定時，如果檢出的色譜峰的保留時間與標準樣品相一致，所選擇的離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致，允許偏差小于±2.5%，則可判斷樣品中存在響應的被測物。

1.6 定量測定

本方法采用內(nèi)標法單離子定量測定，為減少基質(zhì)的影響。黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2以[13C17]-黃曲霉毒素B1為內(nèi)標；T-2毒素以[13C24]-T-2毒素為內(nèi)標；赭曲霉毒素A以[13C20]-赭曲霉毒素A為內(nèi)標；玉米赤霉烯酮以[13C18]-玉米赤霉烯酮為內(nèi)標；嘔吐毒素以[13C15]-嘔吐毒素為內(nèi)標。采用單點或曲線方程進行定量計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

目前，霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈及它們與水的混合溶液為提取劑。本研究在此基礎(chǔ)上，比較了70%、84%(V/V)的乙腈-水溶液的提取效率，并對提取時間、提取方式等條件進行了比較，玉米赤霉烯酮具體檢測結(jié)果見表3，其他幾種霉菌毒素的規(guī)律與玉米赤霉烯酮類似。根據(jù)檢測結(jié)果的比較確定了最佳條件：84%乙腈-水溶液在振蕩90 min或均質(zhì)攪拌3 min時對各霉菌毒素的提取效果總體效果最佳。8種霉菌毒素的回收率均大于80%。

表3 玉米赤霉烯酮不同提取方式對回收率的影響(n=6)

2.2 凈化條件的選擇

固相萃取凈化方法是復雜基質(zhì)中痕量檢測進行凈化的常用方法。本研究對Myco Sep@226型清洗柱和MycoSpin?400多功能凈化柱的凈化效果進行了比較。實驗表明，Myco Sep@226在凈化黃曲霉毒素時具有良好的凈化效果，回收率較穩(wěn)定，但玉米赤霉烯酮的回收率及穩(wěn)定性較差。采用MycoSpin?400多功能凈化柱得到了較為滿意的凈化效果，結(jié)果更加穩(wěn)定。具體檢測結(jié)果見表4。因此，本研究選擇Myco?Spin?400多功能凈化柱作為本方法的凈化柱。

表4 玉米赤霉烯酮不同凈化柱對回收率的影響(n=6)(%)

2.3 色譜柱的選擇

霉菌毒素結(jié)構(gòu)中多含有羧基和羥基，屬于中等極性化合物，易溶于乙腈和甲醇等極性溶劑，在一般的C18色譜柱上有較好的保留，本方法比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm×50 mm，1.7 μm、Agilent SB-C18 2.1 mm×50 mm，1.8 μm和Thermo BDS HYPERSIL C18 2.1 mm×100 mm,2.4 μm色譜柱，經(jīng)使用標準工作液對各規(guī)格色譜柱進樣分離得色譜質(zhì)譜圖。由試驗結(jié)果可見，Thermo BDS HYPER?SIL C18 2.1×100 mm，2.4 μm色譜柱分離效果和靈敏度較好。標準液的選擇離子流圖見圖1。

2.4 流動相的選擇

圖1 8種霉菌毒素標準品的特征離子質(zhì)譜圖（MRM）

要實現(xiàn)8種霉菌霉毒素基線分離，并且達到歐盟對各種黃曲霉毒素的限量要求，必須選擇最為合適的流動相，實驗采用了甲醇-水和乙腈-水兩種常用的流動相，為增加霉菌毒素的離子化效率，在水相中加入10 mmol/l的乙酸銨，經(jīng)比較大部分霉菌毒素使用甲醇的靈敏度要高于乙腈的，且分離度也比乙腈的要高。能夠在最短的時間內(nèi)得到很好的基線分離。最終確定用10 mM乙酸銨和甲醇做流動相。

2.5 內(nèi)標添加時間的選擇

根據(jù)樣品的提取效率，在乙腈+水（84+16）充分提取下，提取效率均高于90%，在考慮內(nèi)標成本較高，選擇過柱前加內(nèi)標。

2.6 方法的性能檢驗

不同種類霉菌毒素在MRM方式下的靈敏度除取決于毒素本身的結(jié)構(gòu)原因外，主要與離子化的效率有關(guān)。將特定濃度的霉菌毒素加入到空白樣品中，然后按本方法樣品預處理方法進行。經(jīng)進樣分離檢測，所得定量限均滿足歐盟規(guī)定。曲線方程、檢出限和定量限見表5。

表5 各種霉菌毒素的線性關(guān)系和檢出限

2.7 方法的回收率及精密度

為了考察方法的準確度，我們對豬配合飼料、濃縮飼料和玉米樣品進行了回收率試驗，采用不同水平的添加量，每個水平平行測定6份。平均回收率在80%~100%之間，相對標準偏差小于10%，表明方法準確度、精密度良好。具體結(jié)果見表6。

表6 8種霉菌毒素平均回收率和相對標準偏差(n=6)

2.8 樣品的測定

為了進一步考察本方法及儀器的準確度，我們對禽配合飼料、濃縮飼料和玉米樣品進行了與免疫親和柱方法的比較試驗。對篩選出的含有霉菌毒素的樣品，同時進行了本方法與免疫親和柱方法檢測，檢測結(jié)果見表7。由結(jié)果可知，該方法與免疫親和柱方法結(jié)果相對標準偏差最大為8.66%，進一步表明方法準確度良好。

3 結(jié)論

本文采用乙腈/水(84/16)混合溶劑為提取液,經(jīng)MycoSpin?400凈化柱凈化，內(nèi)標法定量，平均回收率在80%~100%之間，相對標準偏差小于10%。方法定量限（LOQ）范圍在1.0~40 μg/kg之間。方法前處理簡便、快速，靈敏度、準確度高。能夠適用于飼料及飼料原料中5種霉菌毒素的檢測。