陳錫峰，陳 飛，肖 波，2，黃安慶，

（1．蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州215123；2．鹽城工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 鹽城224051）

microRNA（miRNA）是一類約22個堿基組成的非編碼RNA，它主要與信使RNA（mRNA）的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，使基因“沉默”，達(dá)到調(diào)控下游基因的目的［1］。在細(xì)胞核內(nèi)miRNA也是由RNA聚合酶Ⅱ從基因組起始轉(zhuǎn)錄的［2］，形成約300～1000bp左右的初始轉(zhuǎn)錄本，隨后經(jīng)過Drosha酶的切割產(chǎn)生約100bp的miRNA前體［3］。此時由核孔運(yùn)輸?shù)鞍讓⑶绑wmiRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，再經(jīng)過Dicer酶的切割成為一條約22個堿基對組成的雙鏈。這條雙鏈會被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中（RISC），其中一條鏈會最終降解，另外一條指引沉默復(fù)合物到靶基因的mRNA 3′UTR中行使功能［4］。

心臟組織是機(jī)體重要器官，為機(jī)體承擔(dān)著輸送血液的重要功能。隨著年齡的增長，心臟細(xì)胞的纖維化程度會越來越高，心臟組織的供血能力和各項生理指標(biāo)都會下降，同時各種心臟疾病的發(fā)生概率越來越大，如心肌梗死等。所以如何判斷心臟的年齡，如何對心臟疾病進(jìn)行預(yù)警或者預(yù)防，都需要有一個快速而準(zhǔn)確的檢測指標(biāo)，這對臨床檢測具有重要意義。

哺乳動物miR－34基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄及切割后，最終形成 miR－34a、miR－34b、miR－34c三種成熟體 microRNA。有報道稱miR－34家族與腫瘤細(xì)胞因子p53通路有關(guān)，參與腫瘤、癌癥調(diào)控。并且在果蠅中的研究證明miR－34與果蠅壽命、神經(jīng)元退化有關(guān)［5］。本研究旨在探討miR－34家族在小鼠心臟細(xì)胞中的作用及表達(dá)情況，以其作為心臟衰老的一個檢測指標(biāo)。

1 材料和方法

1．1 材料 TRlzol試劑購自ambion公司，反轉(zhuǎn)錄試劑購 自 Vazyme公 司，qPCR SYBR GREEN 購自TaKaRa公司，DEPC水購自Sigma公司，瓊脂糖凝膠購自上?；蚬荆琍CR反應(yīng)管購自Fisher公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。C57BL／6小鼠購自斯萊克公司。

1．2 方法

1．2．1 RNA提取 采用TRlzol法提取總RNA。將組織研磨碎加入適量TRlzol（1mg組織／1ml Trizol溶液），然后室溫放置，加入1／5體積的氯仿并震蕩離心。此時試管中會分三層，用移液器小心將上層清液轉(zhuǎn)移到新試管中。隨后加入異丙醇，室溫放置10分鐘左右再離心。此時將會在試管底部看到白色沉淀，將異丙醇移除，加入70%的用DEPC水稀釋的酒精，離心后吸出酒精，將試管放置在通風(fēng)廚中，將酒精盡量吹干，最后加入DEPC水溶解。

1．2．2 mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA 按下列組分別依次加入試劑：RNA 2～4μg，oligo（dT），dNTP，DTT，RNA酶抑制劑，逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃90分鐘。

1．2．3 miRNA的反轉(zhuǎn) 由于microRNA的特殊性，它的成熟體只有大約22個堿基，而且無ploy A尾，無法用普通的反轉(zhuǎn)方式將其反轉(zhuǎn)成cDNA。首先加入ploy A加尾酶，然后用特殊的比較長的下游引物和逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)（同mRNA反轉(zhuǎn)），保證microRNA反轉(zhuǎn)后的長度在100～200bp左右，使其可以被PCR檢測出來。RT－PCR反應(yīng)程序：95℃2min、95℃30s、60℃30s、72℃30s、72℃8min；4℃保存。

1．2．4 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系的配制：SYBR GREEN 10μl，正向引物和反向引物各0．4μl，cDNA模板2μl，用雙蒸水補(bǔ)齊到20μl。使用Roche公司的熒光定量PCR儀，熒光定量PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置：94℃30s、94℃20s、60℃20s，循環(huán)40次，60℃單點(diǎn)檢測信號。用相對定量的方式檢測基因表達(dá)量，即目的基因相對于管家基因的量為2－△△Ct。miR－34a的引物序列：正向 TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT，miR－34b的引物序列：正向AGGCAGTGTCATTAGCTGATTGT，miR－34c的引物序列：正向AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC。下游引物為試劑盒自帶引物，內(nèi)參基因為 U6：正向CTCGCTTCGGCAGCACA，反向AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用t檢驗分析實驗結(jié)果。P＜0．05表示有顯著性差異，P＜0．001時，表示有極顯著差異。

2 結(jié)果

2．1 總RNA質(zhì)量檢測 提取組織總RNA后，取1～2μl經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后可以清楚看到三條帶。最上面的兩條帶清晰而且比較亮，分別是28S、18SRNA，RNA基本沒有降解。紫外分光光度計檢測OD260／OD280也在1．8左右，說明RNA提取的質(zhì)量很好，可以進(jìn)行下游實驗，見圖1。

圖1 心臟總RNA檢測Figure 1 Detection of total RNA

2．2 檢測microRNA引物特異性 引物的特異性直接關(guān)系著后續(xù)實驗的可靠性。使用miRNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，分別用miR－34家族的三種引物和通用下游引物檢測其特異性。在RT－PCR完成后，用3%的瓊脂糖凝膠檢測產(chǎn)物。miR－34a、miR－34b、miR－34c三個microRNA的反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物都非常單一，說明引物特異性很好，見圖2。

圖2 引物特異性檢測Figure 2 Specificity of q－PCR primer

2．3 miR－34a表達(dá)量高于 miR－34b和 miR－34c 提取老年小鼠心肌細(xì)胞對miR－34家族進(jìn)行定量檢測，發(fā)現(xiàn)在小鼠中miR－34a的表達(dá)量要顯著高于miR－34b、miR－34c。說明在心肌細(xì)胞中 miR－34a起著更為重要的作用，見圖3。

圖3 老年小鼠心臟組織中miR－34檢測分析Figure 3 Analysis of miR－34in old heart tissue

2．4 miR－34a在老年小鼠心臟中表達(dá)量顯著高于年輕小鼠 比較年輕小鼠（6周）和老年小鼠（12個月），我們發(fā)現(xiàn)miR－34a的表達(dá)量在老年小鼠心臟中表達(dá)量更高，具有顯著性差異。說明miR－34a可能是小鼠心臟功能衰老的一個重要標(biāo)志，參與到與衰老有關(guān)的調(diào)節(jié)通路，見圖4。

2．5 miR－34b與miR－34c在年輕小鼠和老年小鼠中的表達(dá)也有差別，但沒有miR－34a明顯，表明與衰老關(guān)系不是特別緊密，見圖5。

3 討論

圖4 miR－34a在年輕小鼠和老年小鼠心臟中的表達(dá)Figure 4 Expression level of miR－34ain young and old heart

圖5 miR－34b與miR－34c在年輕小鼠和老年小鼠中的表達(dá)Figure 5 Expression level of miR－34band miR－34cin young and old heart

microRNAs是一類在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用的非編碼RNA，小鼠體內(nèi)約有30%的基因受非編碼RNA調(diào)控［6］。人類基因中有3%編碼有microRNAs［7］。部分microRNAs基因在染色體上位于兩個獨(dú)立基因之間，有的位于另一個基因的內(nèi)含子中，有的甚至在其他基因的外顯子中。脊椎動物中microRNAs主要通過成熟體5′端的“種子序列”與靶基因的mRNA 3′UTR區(qū)域結(jié)合，降解mRNA或者抑制蛋白的翻譯，達(dá)到調(diào)控基因的目的［8，9］。也有研究表明，miRNA通過影響5′端帽子和3′端poly A尾來影響mRNA的穩(wěn)定性［10］。很多具有重要功能的microRNAs在進(jìn)化上是非常保守的，尤其是在“種子序列”的6到8個堿基。miR－34就是這樣一個家族，這個家族有三個成員：miR－34a、miR－34b和 miR－34c，先前的研究報道它參與p53調(diào)節(jié)通路，與腫瘤、癌癥的發(fā)生相關(guān)。果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)miR－34家族有7種剪切形式，這主要是由Nbr酶介導(dǎo)的。在果蠅中敲除Nbr基因會減少miR－34家族的剪切種類，使其只有一種形式產(chǎn)生。這7種剪切形式中，它們的“種子序列”都是一樣的，只是3′端有個別堿基不同，其中有三種是主要表達(dá)的，這與小鼠中的miR－34家族是一致的。究發(fā)現(xiàn)miR－34主要在腦部表達(dá)，與果蠅的壽命以及運(yùn)動爬升能力有關(guān)。果蠅 miR－34通過直接調(diào)節(jié)Eip74EF基因控制衰老過程［11］。

心臟組織是機(jī)體血液循環(huán)主要器官而心臟的衰老是機(jī)體衰老的重要標(biāo)志，影響巨大。既然果蠅的miR－34可以調(diào)控機(jī)體衰老，那么對哺乳動物最重要的器官又是什么影響仍有待探索。本研究主要探討miR－34家族在心臟組織中的表達(dá)情況。由于 microRNAs的特殊性，通過加尾法反轉(zhuǎn)成cDNA，同時確認(rèn)了三種不同引物的特異性。首先在小鼠心臟組織中分析了家族三個成員的表達(dá)趨勢，發(fā)現(xiàn)在這其中，miR－34a的表達(dá)量要顯著高于 miR－34b和 miR－34c，提示miR－34a的功能可能更重要些。為了證明在小鼠心臟中miR－34是否也和在果蠅中一致，具有調(diào)節(jié)衰老的作用，分別檢測了年輕小鼠和老年小鼠miR－34a的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR－34a表達(dá)量在老年小鼠心臟中顯著高于年輕小鼠，約有2．5倍，而miR－34b在老年小鼠心臟中也有部分上調(diào)但是沒有miR－34a那么明顯，甚至miR－34c在老年小鼠中有部分下調(diào)，提示我們miR－34a在這個家族中與心臟衰老關(guān)系最緊密。

4 結(jié)論

miR－34a是miR－34家族的主要表達(dá)形式，同時在老年小鼠心臟中表達(dá)更高，可將miR－34a作為心臟衰老的標(biāo)志，也可作為診斷心臟功能的重要指標(biāo)。

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