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        miR-34在小鼠心臟組織中的表達(dá)和功能研究*

        2014-02-27 07:46:24陳錫峰黃安慶
        西部醫(yī)學(xué) 2014年10期
        關(guān)鍵詞:小鼠檢測

        陳錫峰,陳 飛,肖 波,2,黃安慶,

        (1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州215123;2.鹽城工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 鹽城224051)

        microRNA(miRNA)是一類約22個堿基組成的非編碼RNA,它主要與信使RNA(mRNA)的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合,使基因“沉默”,達(dá)到調(diào)控下游基因的目的[1]。在細(xì)胞核內(nèi)miRNA也是由RNA聚合酶Ⅱ從基因組起始轉(zhuǎn)錄的[2],形成約300~1000bp左右的初始轉(zhuǎn)錄本,隨后經(jīng)過Drosha酶的切割產(chǎn)生約100bp的miRNA前體[3]。此時由核孔運(yùn)輸?shù)鞍讓⑶绑wmiRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中,再經(jīng)過Dicer酶的切割成為一條約22個堿基對組成的雙鏈。這條雙鏈會被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中(RISC),其中一條鏈會最終降解,另外一條指引沉默復(fù)合物到靶基因的mRNA 3′UTR中行使功能[4]。

        心臟組織是機(jī)體重要器官,為機(jī)體承擔(dān)著輸送血液的重要功能。隨著年齡的增長,心臟細(xì)胞的纖維化程度會越來越高,心臟組織的供血能力和各項生理指標(biāo)都會下降,同時各種心臟疾病的發(fā)生概率越來越大,如心肌梗死等。所以如何判斷心臟的年齡,如何對心臟疾病進(jìn)行預(yù)警或者預(yù)防,都需要有一個快速而準(zhǔn)確的檢測指標(biāo),這對臨床檢測具有重要意義。

        哺乳動物miR-34基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄及切割后,最終形成 miR-34a、miR-34b、miR-34c三種成熟體 microRNA。有報道稱miR-34家族與腫瘤細(xì)胞因子p53通路有關(guān),參與腫瘤、癌癥調(diào)控。并且在果蠅中的研究證明miR-34與果蠅壽命、神經(jīng)元退化有關(guān)[5]。本研究旨在探討miR-34家族在小鼠心臟細(xì)胞中的作用及表達(dá)情況,以其作為心臟衰老的一個檢測指標(biāo)。

        1 材料和方法

        1.1 材料 TRlzol試劑購自ambion公司,反轉(zhuǎn)錄試劑購 自 Vazyme公 司,qPCR SYBR GREEN 購自TaKaRa公司,DEPC水購自Sigma公司,瓊脂糖凝膠購自上?;蚬荆琍CR反應(yīng)管購自Fisher公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。C57BL/6小鼠購自斯萊克公司。

        1.2 方法

        1.2.1 RNA提取 采用TRlzol法提取總RNA。將組織研磨碎加入適量TRlzol(1mg組織/1ml Trizol溶液),然后室溫放置,加入1/5體積的氯仿并震蕩離心。此時試管中會分三層,用移液器小心將上層清液轉(zhuǎn)移到新試管中。隨后加入異丙醇,室溫放置10分鐘左右再離心。此時將會在試管底部看到白色沉淀,將異丙醇移除,加入70%的用DEPC水稀釋的酒精,離心后吸出酒精,將試管放置在通風(fēng)廚中,將酒精盡量吹干,最后加入DEPC水溶解。

        1.2.2 mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA 按下列組分別依次加入試劑:RNA 2~4μg,oligo(dT),dNTP,DTT,RNA酶抑制劑,逆轉(zhuǎn)錄酶,37℃90分鐘。

        1.2.3 miRNA的反轉(zhuǎn) 由于microRNA的特殊性,它的成熟體只有大約22個堿基,而且無ploy A尾,無法用普通的反轉(zhuǎn)方式將其反轉(zhuǎn)成cDNA。首先加入ploy A加尾酶,然后用特殊的比較長的下游引物和逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)(同mRNA反轉(zhuǎn)),保證microRNA反轉(zhuǎn)后的長度在100~200bp左右,使其可以被PCR檢測出來。RT-PCR反應(yīng)程序:95℃2min、95℃30s、60℃30s、72℃30s、72℃8min;4℃保存。

        1.2.4 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系的配制:SYBR GREEN 10μl,正向引物和反向引物各0.4μl,cDNA模板2μl,用雙蒸水補(bǔ)齊到20μl。使用Roche公司的熒光定量PCR儀,熒光定量PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置:94℃30s、94℃20s、60℃20s,循環(huán)40次,60℃單點(diǎn)檢測信號。用相對定量的方式檢測基因表達(dá)量,即目的基因相對于管家基因的量為2-△△Ct。miR-34a的引物序列:正向 TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT,miR-34b的引物序列:正向AGGCAGTGTCATTAGCTGATTGT,miR-34c的引物序列:正向AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC。下游引物為試劑盒自帶引物,內(nèi)參基因為 U6:正向CTCGCTTCGGCAGCACA,反向AACGCTTCACGAATTTGCGT。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,用t檢驗分析實驗結(jié)果。P<0.05表示有顯著性差異,P<0.001時,表示有極顯著差異。

        2 結(jié)果

        2.1 總RNA質(zhì)量檢測 提取組織總RNA后,取1~2μl經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,EB染色后可以清楚看到三條帶。最上面的兩條帶清晰而且比較亮,分別是28S、18SRNA,RNA基本沒有降解。紫外分光光度計檢測OD260/OD280也在1.8左右,說明RNA提取的質(zhì)量很好,可以進(jìn)行下游實驗,見圖1。

        圖1 心臟總RNA檢測Figure 1 Detection of total RNA

        2.2 檢測microRNA引物特異性 引物的特異性直接關(guān)系著后續(xù)實驗的可靠性。使用miRNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板,分別用miR-34家族的三種引物和通用下游引物檢測其特異性。在RT-PCR完成后,用3%的瓊脂糖凝膠檢測產(chǎn)物。miR-34a、miR-34b、miR-34c三個microRNA的反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物都非常單一,說明引物特異性很好,見圖2。

        圖2 引物特異性檢測Figure 2 Specificity of q-PCR primer

        2.3 miR-34a表達(dá)量高于 miR-34b和 miR-34c 提取老年小鼠心肌細(xì)胞對miR-34家族進(jìn)行定量檢測,發(fā)現(xiàn)在小鼠中miR-34a的表達(dá)量要顯著高于miR-34b、miR-34c。說明在心肌細(xì)胞中 miR-34a起著更為重要的作用,見圖3。

        圖3 老年小鼠心臟組織中miR-34檢測分析Figure 3 Analysis of miR-34in old heart tissue

        2.4 miR-34a在老年小鼠心臟中表達(dá)量顯著高于年輕小鼠 比較年輕小鼠(6周)和老年小鼠(12個月),我們發(fā)現(xiàn)miR-34a的表達(dá)量在老年小鼠心臟中表達(dá)量更高,具有顯著性差異。說明miR-34a可能是小鼠心臟功能衰老的一個重要標(biāo)志,參與到與衰老有關(guān)的調(diào)節(jié)通路,見圖4。

        2.5 miR-34b與miR-34c在年輕小鼠和老年小鼠中的表達(dá)也有差別,但沒有miR-34a明顯,表明與衰老關(guān)系不是特別緊密,見圖5。

        3 討論

        圖4 miR-34a在年輕小鼠和老年小鼠心臟中的表達(dá)Figure 4 Expression level of miR-34ain young and old heart

        圖5 miR-34b與miR-34c在年輕小鼠和老年小鼠中的表達(dá)Figure 5 Expression level of miR-34band miR-34cin young and old heart

        microRNAs是一類在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用的非編碼RNA,小鼠體內(nèi)約有30%的基因受非編碼RNA調(diào)控[6]。人類基因中有3%編碼有microRNAs[7]。部分microRNAs基因在染色體上位于兩個獨(dú)立基因之間,有的位于另一個基因的內(nèi)含子中,有的甚至在其他基因的外顯子中。脊椎動物中microRNAs主要通過成熟體5′端的“種子序列”與靶基因的mRNA 3′UTR區(qū)域結(jié)合,降解mRNA或者抑制蛋白的翻譯,達(dá)到調(diào)控基因的目的[8,9]。也有研究表明,miRNA通過影響5′端帽子和3′端poly A尾來影響mRNA的穩(wěn)定性[10]。很多具有重要功能的microRNAs在進(jìn)化上是非常保守的,尤其是在“種子序列”的6到8個堿基。miR-34就是這樣一個家族,這個家族有三個成員:miR-34a、miR-34b和 miR-34c,先前的研究報道它參與p53調(diào)節(jié)通路,與腫瘤、癌癥的發(fā)生相關(guān)。果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)miR-34家族有7種剪切形式,這主要是由Nbr酶介導(dǎo)的。在果蠅中敲除Nbr基因會減少miR-34家族的剪切種類,使其只有一種形式產(chǎn)生。這7種剪切形式中,它們的“種子序列”都是一樣的,只是3′端有個別堿基不同,其中有三種是主要表達(dá)的,這與小鼠中的miR-34家族是一致的。究發(fā)現(xiàn)miR-34主要在腦部表達(dá),與果蠅的壽命以及運(yùn)動爬升能力有關(guān)。果蠅 miR-34通過直接調(diào)節(jié)Eip74EF基因控制衰老過程[11]。

        心臟組織是機(jī)體血液循環(huán)主要器官而心臟的衰老是機(jī)體衰老的重要標(biāo)志,影響巨大。既然果蠅的miR-34可以調(diào)控機(jī)體衰老,那么對哺乳動物最重要的器官又是什么影響仍有待探索。本研究主要探討miR-34家族在心臟組織中的表達(dá)情況。由于 microRNAs的特殊性,通過加尾法反轉(zhuǎn)成cDNA,同時確認(rèn)了三種不同引物的特異性。首先在小鼠心臟組織中分析了家族三個成員的表達(dá)趨勢,發(fā)現(xiàn)在這其中,miR-34a的表達(dá)量要顯著高于 miR-34b和 miR-34c,提示miR-34a的功能可能更重要些。為了證明在小鼠心臟中miR-34是否也和在果蠅中一致,具有調(diào)節(jié)衰老的作用,分別檢測了年輕小鼠和老年小鼠miR-34a的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)量在老年小鼠心臟中顯著高于年輕小鼠,約有2.5倍,而miR-34b在老年小鼠心臟中也有部分上調(diào)但是沒有miR-34a那么明顯,甚至miR-34c在老年小鼠中有部分下調(diào),提示我們miR-34a在這個家族中與心臟衰老關(guān)系最緊密。

        4 結(jié)論

        miR-34a是miR-34家族的主要表達(dá)形式,同時在老年小鼠心臟中表達(dá)更高,可將miR-34a作為心臟衰老的標(biāo)志,也可作為診斷心臟功能的重要指標(biāo)。

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