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        關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷早期關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸對軟骨細(xì)胞凋亡的影響

        2014-02-27 07:46:20尤建川張延玖何青松李銀和
        西部醫(yī)學(xué) 2014年8期
        關(guān)鍵詞:透明質(zhì)法測定細(xì)胞周期

        尤建川,張延玖,何青松,李銀和

        (達州市中心醫(yī)院急診外科,四川 達州635000)

        通常而言,利用關(guān)節(jié)腔(Joint cavity,JC)內(nèi)注射透明質(zhì)酸(HA),對于骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)疾病的治療有較好療效,此法亦在臨床廣泛使用。在發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷(Articular cartilage injury,ACI)后,CC凋亡高峰往往處于損傷之后的早期[1]。在ACI早期即以HA行JC內(nèi)注射,對于病患可能比形成創(chuàng)傷型關(guān)節(jié)炎之后再行JC內(nèi)注射所獲療效顯著。但由于HA緩解軟骨細(xì)胞(Cartilage cells,CC)損傷的主要機制仍未明確,且HA作用機制與CC凋亡是否有一定聯(lián)系,目前仍不甚明確[2]。鑒于此,本文通過對ACI后早期患者行JC內(nèi)注射HA,探討其對CC凋亡產(chǎn)生的影響,現(xiàn)報告如下。

        1 資料和方法

        1.1 臨床資料 2010年3月~2013年3月,我院有78例患者被確診為ACI,其中男36例,女42例,年齡56~73歲,平均年齡(63.3±3.8)歲。入選者均滿足中華醫(yī)學(xué)會下屬骨科學(xué)分會2007年制定的ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)[4]:①有嚴(yán)重胃病或結(jié)締組織類病癥者,有風(fēng)濕免疫類病癥者,有血液腫瘤型病癥亦或是內(nèi)分泌代謝類病癥者。②有嚴(yán)重心腦肝腎及其他臟器等功能性障礙者。以數(shù)字法隨機分成觀察組和對照組各39例。兩組在性別、年齡以及病變情況等方面對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

        1.2 研究方法 對照組僅以ACI常規(guī)抗感染以及手術(shù)等方案治療,觀察組在ACI早期縫合皮膚前行JC內(nèi)注射 HA(產(chǎn)于江蘇常州的藥物研究所,規(guī)格:25mg/2.5ml,藥品批號:091003),劑量為2.5ml。

        1.3 標(biāo)本提取 在兩組患者創(chuàng)傷之后(觀察組在ACI早期縫合皮膚前行JC內(nèi)注射HA之后操作)提取兩組損傷處四周直徑約3mm的軟骨。平均分成2份,一份以流式細(xì)胞儀檢測CC凋亡;另一份以TUNEL法觀察CC凋亡。

        1.4 流式細(xì)胞儀測定過程 將軟骨剪碎后置入離心管內(nèi),行PBS沖洗,在2000r/min下離心約10min,除掉上清液。以0.25%胰蛋白酶進行30min消化處理。在2000r/min下離心約10min,除掉上清液。以0.2%的Ⅱ膠原酶于37℃的恒溫箱中消化,隔1h吹打一次。4小時后待軟骨全部溶解,實施過濾和漂洗,計數(shù)并制備細(xì)胞懸液(>1×106/ml),另加進PI染液,避光下20min,以流式細(xì)胞儀測定。經(jīng)DNA Reagent Kit操作以及Modfit軟件對細(xì)胞周期實施分析。增殖指數(shù)(Proliferation index,PI)=(S+G2M)/(S+G2M+G0/G1)。

        1.5 TUNEL法測定CC凋亡率 將兩組軟骨經(jīng)10%福爾馬林液固定,時間>48h。而后遞增濃度以乙醇脫水,行石蠟包埋,連續(xù)實施5μm切片,PBS替代一抗用于陰性對照,凋亡CC呈現(xiàn)棕黃色。以雙盲法統(tǒng)計10個高倍視野。計算100個細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù),并取平均值以作CC凋亡率。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS 13.0軟件進行分析,計量數(shù)據(jù)行t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 流式細(xì)胞儀測定CC凋亡情況對比 觀察組以流式細(xì)胞儀測定的CC凋亡率為(3.63±0.46)%,顯著低于對照組的(6.87±0.85)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示ACI早期以HA行JC內(nèi)注射可明顯降低CC凋亡率,見表1。

        2.2 TUNEL法測定CC凋亡情況對比 觀察組以TUNEL法測定的CC凋亡率為(2.98±0.23)%,顯著低于對照組的(6.54±0.17)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示ACI早期以HA行JC內(nèi)注射對降低CC凋亡情況的效果明顯,見表2。

        表1 流式細(xì)胞儀測定情況對比(±s)Table 1 Comparison of flow cytometry instrument’s test

        表1 流式細(xì)胞儀測定情況對比(±s)Table 1 Comparison of flow cytometry instrument’s test

        注:與對照組相比,①P<0.05

        組別 n 凋亡率(×10-2觀察組 39 3.63±0.46①對照組 39 6.87±0.85 t 20.94 P<0.05

        表2 TUNEL法測定CC凋亡情況對比(±s)Table 2 Comparison of Tunel way to test CC apoptosis

        表2 TUNEL法測定CC凋亡情況對比(±s)Table 2 Comparison of Tunel way to test CC apoptosis

        注:與對照組相比,①P<0.05

        組別 n 凋亡率(×10-2)觀察組 39 2.98±0.23①對照組 39 6.54±0.17 t 77.73 P<0.05

        2.3 兩組CC細(xì)胞周期情況對比 觀察組G0/G1為82.21±2.02,顯著低于對照組的91.32±3.65;S、G2/M、PI分別為8.74±2.65、9.08±1.65和 17.81±1.65,均顯著高于對照組的3.65±0.27、5.05±0.54和8.71±1.05,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。從而提示ACI早期以HA行JC內(nèi)注射可優(yōu)化細(xì)胞周期,見表3。

        表3 兩組CC細(xì)胞周期情況對比(±s)Table 3 Comparison of 2groups of CC cell cycle

        表3 兩組CC細(xì)胞周期情況對比(±s)Table 3 Comparison of 2groups of CC cell cycle

        組別 n G0/G1 S G2/M PI觀察組 39 82.21±2.02 8.74±2.65 9.08±1.65 17.81±1.65對照組 39 91.32±3.65 3.65±0.27 5.05±0.54 8.71±1.05 t 13.64 11.93 14.50 29.06 P<0.05 <0.05 <0.05 <0.05

        3 討論

        有報道表明[5],發(fā)生ACI后,患者CC將發(fā)生凋亡。因此,在臨床上若能抑制或減緩CC凋亡,則可能對后續(xù)治療產(chǎn)生積極意義。HA又稱為玻璃酸,其是由Meyer及Palmer等人在1934年時,自牛眼玻璃體內(nèi)分離而得。而后發(fā)現(xiàn)其廣泛存于動物及人類機體細(xì)胞的外基質(zhì)內(nèi)。HA亦為生物活性類物質(zhì),是線形多糖。其分子量有所差異,不含均一性。通常在50萬至200萬間對人體不含抗原性,可發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞間纖維以及膜蛋白的結(jié)構(gòu)等作用。以往主要將其用于預(yù)防及治療OA等疾病,亦取得了一定療效。因CC表面含有HA受體,HA同細(xì)胞表面疏水蛋白經(jīng)共價鍵方式結(jié)合,從而產(chǎn)生作用[5]。因此HA可防止病患關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生凋亡及壞死。鑒于此,本文通過對ACI后早期病患行JC內(nèi)注射HA,探討其對CC凋亡產(chǎn)生的影響。

        本研究發(fā)現(xiàn),ACI后早期病患行JC內(nèi)注射HA的觀察組以TUNEL法測定的CC凋亡率以及TUNEL法測定的CC凋亡率均顯著低于對照組的水平。而觀察組G0/G1水平,顯著低于對照組;但S、G2/M、PI均顯著高于對照組的水平。與宋長志,鄭閩前等人[7]報道一致,究其原因,主要是HA作為病患關(guān)節(jié)滑液及軟骨的一種組成部分,可發(fā)揮關(guān)節(jié)潤滑和營養(yǎng),以及修復(fù)病患關(guān)節(jié)軟骨等效果[8]。發(fā)生ACI后,因患處HA水平降低,損傷了軟骨完整性,導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛,以及其他功能性障礙。對于JC內(nèi)注射并補充外源HA,提升了JC內(nèi)HA濃度含量。通過修復(fù)被破壞的生理性屏障,從而緩解了關(guān)節(jié)活動,并利于滑膜細(xì)胞生成機體自身HA以修復(fù)軟骨。此外,發(fā)生ACI后,軟骨細(xì)胞增殖活力明顯下降,而代謝能力卻依然有少量存在,在細(xì)胞內(nèi)蓄積有部分胞內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA,而細(xì)胞無法分裂,因此發(fā)生不平衡性生長。此種狀態(tài)若持續(xù)較長時間,則會誘發(fā)細(xì)胞壞死及凋亡,從而顯著提升CC凋亡率。何翠蓉等人[9]報道證實,ACI后早期病患行JC內(nèi)注射HA,CC凋亡率明顯降低約3倍左右,本文為2.19倍,與其報道基本一致。而陸炳全等人[10]亦研究稱CC過度凋亡和ACI形成創(chuàng)傷型關(guān)節(jié)炎有緊密聯(lián)系。

        在細(xì)胞周期方面,由于其與細(xì)胞的生命活動有緊密聯(lián)系。調(diào)控主要針對于細(xì)胞周期的有關(guān)限制點,同時由多因素一起參與。在細(xì)胞周期內(nèi),通常有2個限制點,即G1/S限制點,主要開始于DNA合成期。而另1個則是G2/M限制點,主要開始于有絲分裂時期。而增殖指數(shù)和S期的比例通??勺鳛榧?xì)胞增殖重要性指標(biāo),因此本文在研究CC凋亡的基礎(chǔ)上對增殖加以附帶研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HA治療后,PI指數(shù)明顯上升,這可能是HA在臨床上對于OA等疾病治療后有較好療效的一些機理。而本文在研究后發(fā)現(xiàn)觀察組CC增殖活力明顯增強的同時CC凋亡率明顯下降,國外Trigkilidas D等人[11]經(jīng)研究后亦發(fā)現(xiàn),ACI后早期行JC內(nèi)注射以補充外源HA,可明顯促進CC增殖,同時降低CC凋亡。這亦可能是對ACI治療的一種有效途徑。然而此種情況的信號通路仍然不甚明確,仍需深入研究下去。

        4 結(jié)論

        ACI后早期患者行JC內(nèi)注射HA,可明顯減少CC凋亡,促進患者康復(fù),療效肯定,值得臨床推廣應(yīng)用。

        [1] 王昌耀,于 麗,王英振,等.不同濃度透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2011,5(21):6213-6220.

        [2] 劉培才,王 東,彭 誠,等.透明質(zhì)酸鈉對顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者關(guān)節(jié)滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶2、3的影響[J].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,5(4):356-360.

        [3] 周建林,劉世清,邱 波,等.透明質(zhì)酸鈉關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對兔軟骨的保護作用及對過氧化物酶體增殖物激活受體γmRNA表達的影響[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2009,13(2):120-123.

        [4] 鄧天政,呂 晶,楊捷緋,等.組織工程骨-軟骨復(fù)合組織體內(nèi)異位移植的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué),2013,22(1):51-54.

        [5] 朱藍玉,秦彥國,黃衛(wèi)東,等.骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中透明質(zhì)酸的表達水平[J].中國老年學(xué)雜志,2013,33(10):2327-2328.

        [6] 孫曉輝.細(xì)胞因子信號抑制因子在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞的表達[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,29(2):186-189.

        [7] 宋長志,鄭閩前,周曉曄,等.創(chuàng)傷后早期關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響[J].實用骨科雜志,2013,19(1):41-43.

        [8] 王琮仁,張 壽.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與透明質(zhì)酸鈉復(fù)合修復(fù)軟骨的實驗研究[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2013,17(9):1-4.

        [9] 何翠蓉,伍 帆.透明質(zhì)酸鈉在青光眼小梁切除術(shù)中的應(yīng)用[J].西部醫(yī)學(xué),2010,22(4):727-728.

        [10] 陸炳全,黃素碧.玻璃酸鈉治療膝骨性關(guān)節(jié)炎60例療效觀察[J].西部醫(yī)學(xué),2010,22(11):2110-2110.

        [11] Trigkilidas D,Anand A.The effectiveness of hyaluronic acid intra-articular injections in managing osteoarthritic knee pain[J].Ann R Coll Surg Engl,2013,95(8):545-551.

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