尤建川，張延玖，何青松，李銀和

（達(dá)州市中心醫(yī)院急診外科，四川 達(dá)州635000）

通常而言，利用關(guān)節(jié)腔（Joint cavity，JC）內(nèi)注射透明質(zhì)酸（HA），對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）疾病的治療有較好療效，此法亦在臨床廣泛使用。在發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷（Articular cartilage injury，ACI）后，CC凋亡高峰往往處于損傷之后的早期［1］。在ACI早期即以HA行JC內(nèi)注射，對(duì)于病患可能比形成創(chuàng)傷型關(guān)節(jié)炎之后再行JC內(nèi)注射所獲療效顯著。但由于HA緩解軟骨細(xì)胞（Cartilage cells，CC）損傷的主要機(jī)制仍未明確，且HA作用機(jī)制與CC凋亡是否有一定聯(lián)系，目前仍不甚明確［2］。鑒于此，本文通過對(duì)ACI后早期患者行JC內(nèi)注射HA，探討其對(duì)CC凋亡產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1．1 臨床資料 2010年3月～2013年3月，我院有78例患者被確診為ACI，其中男36例，女42例，年齡56～73歲，平均年齡（63．3±3．8）歲。入選者均滿足中華醫(yī)學(xué)會(huì)下屬骨科學(xué)分會(huì)2007年制定的ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。排除標(biāo)準(zhǔn)［4］：①有嚴(yán)重胃病或結(jié)締組織類病癥者，有風(fēng)濕免疫類病癥者，有血液腫瘤型病癥亦或是內(nèi)分泌代謝類病癥者。②有嚴(yán)重心腦肝腎及其他臟器等功能性障礙者。以數(shù)字法隨機(jī)分成觀察組和對(duì)照組各39例。兩組在性別、年齡以及病變情況等方面對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），具有可比性。

1．2 研究方法 對(duì)照組僅以ACI常規(guī)抗感染以及手術(shù)等方案治療，觀察組在ACI早期縫合皮膚前行JC內(nèi)注射 HA（產(chǎn)于江蘇常州的藥物研究所，規(guī)格：25mg／2．5ml，藥品批號(hào)：091003），劑量為2．5ml。

1．3 標(biāo)本提取 在兩組患者創(chuàng)傷之后（觀察組在ACI早期縫合皮膚前行JC內(nèi)注射HA之后操作）提取兩組損傷處四周直徑約3mm的軟骨。平均分成2份，一份以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CC凋亡；另一份以TUNEL法觀察CC凋亡。

1．4 流式細(xì)胞儀測(cè)定過程 將軟骨剪碎后置入離心管內(nèi)，行PBS沖洗，在2000r／min下離心約10min，除掉上清液。以0．25%胰蛋白酶進(jìn)行30min消化處理。在2000r／min下離心約10min，除掉上清液。以0．2%的Ⅱ膠原酶于37℃的恒溫箱中消化，隔1h吹打一次。4小時(shí)后待軟骨全部溶解，實(shí)施過濾和漂洗，計(jì)數(shù)并制備細(xì)胞懸液（＞1×106／ml），另加進(jìn)PI染液，避光下20min，以流式細(xì)胞儀測(cè)定。經(jīng)DNA Reagent Kit操作以及Modfit軟件對(duì)細(xì)胞周期實(shí)施分析。增殖指數(shù)（Proliferation index，PI）＝（S＋G2M）／（S＋G2M＋G0／G1）。

1．5 TUNEL法測(cè)定CC凋亡率 將兩組軟骨經(jīng)10%福爾馬林液固定，時(shí)間＞48h。而后遞增濃度以乙醇脫水，行石蠟包埋，連續(xù)實(shí)施5μm切片，PBS替代一抗用于陰性對(duì)照，凋亡CC呈現(xiàn)棕黃色。以雙盲法統(tǒng)計(jì)10個(gè)高倍視野。計(jì)算100個(gè)細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)，并取平均值以作CC凋亡率。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)行t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 流式細(xì)胞儀測(cè)定CC凋亡情況對(duì)比 觀察組以流式細(xì)胞儀測(cè)定的CC凋亡率為（3．63±0．46）%，顯著低于對(duì)照組的（6．87±0．85）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。提示ACI早期以HA行JC內(nèi)注射可明顯降低CC凋亡率，見表1。

2．2 TUNEL法測(cè)定CC凋亡情況對(duì)比 觀察組以TUNEL法測(cè)定的CC凋亡率為（2．98±0．23）%，顯著低于對(duì)照組的（6．54±0．17）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。提示ACI早期以HA行JC內(nèi)注射對(duì)降低CC凋亡情況的效果明顯，見表2。

表1 流式細(xì)胞儀測(cè)定情況對(duì)比（±s）Table 1 Comparison of flow cytometry instrument’s test

表1 流式細(xì)胞儀測(cè)定情況對(duì)比（±s）Table 1 Comparison of flow cytometry instrument’s test

注：與對(duì)照組相比，①P＜0．05

組別 n 凋亡率（×10－2觀察組 39 3．63±0．46①對(duì)照組 39 6．87±0．85 t 20．94 P＜0．05

表2 TUNEL法測(cè)定CC凋亡情況對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of Tunel way to test CC apoptosis

表2 TUNEL法測(cè)定CC凋亡情況對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of Tunel way to test CC apoptosis

注：與對(duì)照組相比，①P＜0．05

組別 n 凋亡率（×10－2）觀察組 39 2．98±0．23①對(duì)照組 39 6．54±0．17 t 77．73 P＜0．05

2．3 兩組CC細(xì)胞周期情況對(duì)比 觀察組G0／G1為82．21±2．02，顯著低于對(duì)照組的91．32±3．65；S、G2／M、PI分別為8．74±2．65、9．08±1．65和 17．81±1．65，均顯著高于對(duì)照組的3．65±0．27、5．05±0．54和8．71±1．05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。從而提示ACI早期以HA行JC內(nèi)注射可優(yōu)化細(xì)胞周期，見表3。

表3 兩組CC細(xì)胞周期情況對(duì)比（±s）Table 3 Comparison of 2groups of CC cell cycle

表3 兩組CC細(xì)胞周期情況對(duì)比（±s）Table 3 Comparison of 2groups of CC cell cycle

組別 n G0／G1 S G2／M PI觀察組 39 82．21±2．02 8．74±2．65 9．08±1．65 17．81±1．65對(duì)照組 39 91．32±3．65 3．65±0．27 5．05±0．54 8．71±1．05 t 13．64 11．93 14．50 29．06 P＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

3 討論

有報(bào)道表明［5］，發(fā)生ACI后，患者CC將發(fā)生凋亡。因此，在臨床上若能抑制或減緩CC凋亡，則可能對(duì)后續(xù)治療產(chǎn)生積極意義。HA又稱為玻璃酸，其是由Meyer及Palmer等人在1934年時(shí)，自牛眼玻璃體內(nèi)分離而得。而后發(fā)現(xiàn)其廣泛存于動(dòng)物及人類機(jī)體細(xì)胞的外基質(zhì)內(nèi)。HA亦為生物活性類物質(zhì)，是線形多糖。其分子量有所差異，不含均一性。通常在50萬至200萬間對(duì)人體不含抗原性，可發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞間纖維以及膜蛋白的結(jié)構(gòu)等作用。以往主要將其用于預(yù)防及治療OA等疾病，亦取得了一定療效。因CC表面含有HA受體，HA同細(xì)胞表面疏水蛋白經(jīng)共價(jià)鍵方式結(jié)合，從而產(chǎn)生作用［5］。因此HA可防止病患關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生凋亡及壞死。鑒于此，本文通過對(duì)ACI后早期病患行JC內(nèi)注射HA，探討其對(duì)CC凋亡產(chǎn)生的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACI后早期病患行JC內(nèi)注射HA的觀察組以TUNEL法測(cè)定的CC凋亡率以及TUNEL法測(cè)定的CC凋亡率均顯著低于對(duì)照組的水平。而觀察組G0／G1水平，顯著低于對(duì)照組；但S、G2／M、PI均顯著高于對(duì)照組的水平。與宋長(zhǎng)志，鄭閩前等人［7］報(bào)道一致，究其原因，主要是HA作為病患關(guān)節(jié)滑液及軟骨的一種組成部分，可發(fā)揮關(guān)節(jié)潤(rùn)滑和營(yíng)養(yǎng)，以及修復(fù)病患關(guān)節(jié)軟骨等效果［8］。發(fā)生ACI后，因患處HA水平降低，損傷了軟骨完整性，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，以及其他功能性障礙。對(duì)于JC內(nèi)注射并補(bǔ)充外源HA，提升了JC內(nèi)HA濃度含量。通過修復(fù)被破壞的生理性屏障，從而緩解了關(guān)節(jié)活動(dòng)，并利于滑膜細(xì)胞生成機(jī)體自身HA以修復(fù)軟骨。此外，發(fā)生ACI后，軟骨細(xì)胞增殖活力明顯下降，而代謝能力卻依然有少量存在，在細(xì)胞內(nèi)蓄積有部分胞內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA，而細(xì)胞無法分裂，因此發(fā)生不平衡性生長(zhǎng)。此種狀態(tài)若持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，則會(huì)誘發(fā)細(xì)胞壞死及凋亡，從而顯著提升CC凋亡率。何翠蓉等人［9］報(bào)道證實(shí)，ACI后早期病患行JC內(nèi)注射HA，CC凋亡率明顯降低約3倍左右，本文為2．19倍，與其報(bào)道基本一致。而陸炳全等人［10］亦研究稱CC過度凋亡和ACI形成創(chuàng)傷型關(guān)節(jié)炎有緊密聯(lián)系。

在細(xì)胞周期方面，由于其與細(xì)胞的生命活動(dòng)有緊密聯(lián)系。調(diào)控主要針對(duì)于細(xì)胞周期的有關(guān)限制點(diǎn)，同時(shí)由多因素一起參與。在細(xì)胞周期內(nèi)，通常有2個(gè)限制點(diǎn)，即G1／S限制點(diǎn)，主要開始于DNA合成期。而另1個(gè)則是G2／M限制點(diǎn)，主要開始于有絲分裂時(shí)期。而增殖指數(shù)和S期的比例通?？勺鳛榧?xì)胞增殖重要性指標(biāo)，因此本文在研究CC凋亡的基礎(chǔ)上對(duì)增殖加以附帶研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HA治療后，PI指數(shù)明顯上升，這可能是HA在臨床上對(duì)于OA等疾病治療后有較好療效的一些機(jī)理。而本文在研究后發(fā)現(xiàn)觀察組CC增殖活力明顯增強(qiáng)的同時(shí)CC凋亡率明顯下降，國外Trigkilidas D等人［11］經(jīng)研究后亦發(fā)現(xiàn)，ACI后早期行JC內(nèi)注射以補(bǔ)充外源HA，可明顯促進(jìn)CC增殖，同時(shí)降低CC凋亡。這亦可能是對(duì)ACI治療的一種有效途徑。然而此種情況的信號(hào)通路仍然不甚明確，仍需深入研究下去。

4 結(jié)論

ACI后早期患者行JC內(nèi)注射HA，可明顯減少CC凋亡，促進(jìn)患者康復(fù)，療效肯定，值得臨床推廣應(yīng)用。

［1］ 王昌耀，于 麗，王英振，等．不同濃度透明質(zhì)酸對(duì)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響［J］．中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2011，5（21）：6213－6220．

［2］ 劉培才，王 東，彭 誠，等．透明質(zhì)酸鈉對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者關(guān)節(jié)滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶2、3的影響［J］．中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，5（4）：356－360．

［3］ 周建林，劉世清，邱 波，等．透明質(zhì)酸鈉關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對(duì)兔軟骨的保護(hù)作用及對(duì)過氧化物酶體增殖物激活受體γmRNA表達(dá)的影響［J］．中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2009，13（2）：120－123．

［4］ 鄧天政，呂 晶，楊捷緋，等．組織工程骨－軟骨復(fù)合組織體內(nèi)異位移植的研究［J］．中國美容醫(yī)學(xué)，2013，22（1）：51－54．

［5］ 朱藍(lán)玉，秦彥國，黃衛(wèi)東，等．骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中透明質(zhì)酸的表達(dá)水平［J］．中國老年學(xué)雜志，2013，33（10）：2327－2328．

［6］ 孫曉輝．細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞的表達(dá)［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（2）：186－189．

［7］ 宋長(zhǎng)志，鄭閩前，周曉曄，等．創(chuàng)傷后早期關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響［J］．實(shí)用骨科雜志，2013，19（1）：41－43．

［8］ 王琮仁，張 壽．兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與透明質(zhì)酸鈉復(fù)合修復(fù)軟骨的實(shí)驗(yàn)研究［J］．實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2013，17（9）：1－4．

［9］ 何翠蓉，伍 帆．透明質(zhì)酸鈉在青光眼小梁切除術(shù)中的應(yīng)用［J］．西部醫(yī)學(xué)，2010，22（4）：727－728．

［10］ 陸炳全，黃素碧．玻璃酸鈉治療膝骨性關(guān)節(jié)炎60例療效觀察［J］．西部醫(yī)學(xué)，2010，22（11）：2110－2110．

［11］ Trigkilidas D，Anand A．The effectiveness of hyaluronic acid intra－articular injections in managing osteoarthritic knee pain［J］．Ann R Coll Surg Engl，2013，95（8）：545－551．