朱建楠，朱 艷

宮頸癌是僅次于乳腺癌在世界范圍內(nèi)最常見的女性癌癥［1］。全球每年女性癌癥新發(fā)病例中9%為宮頸癌，8%的女性癌癥患者死于該病［2］。目前，已經(jīng)證實(shí)70%宮頸癌的發(fā)生與兩種高危型人乳頭瘤病毒 (human papillomavirus，HPV)——HPV16和HPV18持續(xù)感染有關(guān)［3］。在臨床上對(duì)于感染HPV的女性尚缺乏有效的干預(yù)治療。黃芪是多年生草本植物，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保護(hù)肝臟、抗衰老和抗菌，可用于癌癥的治療［4］。但對(duì)于宮頸癌前病變細(xì)胞的作用尚缺乏研究報(bào)道。本研究以宮頸永生化上皮細(xì)胞 (H8)作為宮頸癌前病變的體外實(shí)驗(yàn)研究模型，研究不同濃度黃芪注射液抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 H8購自上海拜力生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM/HIGH培養(yǎng)液置于37℃、5%二氧化碳(CO2)的恒溫培箱中培養(yǎng)，用0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 黃芪注射液購自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):12120342，10 ml/支 (相當(dāng)于原藥材20 g)。

1.3 主要試劑 DMEM/HIGH培養(yǎng)基 (賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，Bioind優(yōu)級(jí)胎牛血清 (上海創(chuàng)未生物技術(shù)有限公司)，Bcl－2、Bax抗體 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，p53抗體 (美國(guó)Proteintech Group公司);流式試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.4 儀器 Olympus－LX70倒置顯微鏡;HEARcel 1150培養(yǎng)箱;超凈工作臺(tái);中國(guó)DNM－9602G酶標(biāo)分析儀;美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀;美國(guó)Bio－Rad伯樂043BR119 12半干轉(zhuǎn)印儀;美國(guó)Bio－Rad伯樂041BR24044電泳槽;曝光顯影系統(tǒng)。

1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法 (MTT法)檢測(cè)黃芪注射液對(duì)H8的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H8用0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液接種于96孔板，100 μl/孔，共5組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。24 h后，藥物處理組分別換以含黃芪終濃度100、200、500、1 000 g/L的培養(yǎng)液孵育，空白對(duì)照組以DMEM培養(yǎng)液，藥物處理24、48、72 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄孔內(nèi)上清液，每孔加入二甲基亞砜 (DMSO)150 μl，振蕩混勻10 min，使結(jié)晶溶解;用自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀在波長(zhǎng)為490 nm時(shí)測(cè)定每孔的光密度值 (即OD值)。細(xì)胞抑制率 (%)=(1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.6 Annexin V－FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H8接種于6孔板，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組收集不同濃度的黃芪注射液處理48 h后的H8，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次 (離心半徑13.5 cm，2 000 r/min，5 min)，收集細(xì)胞于流式管中;加入500 μl的Buffer懸浮細(xì)胞;加入Annexin V－FITC和Propidium lodide各5 μl，室溫、避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng) (EX)=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng) (EM)=530 nm測(cè)試細(xì)胞凋亡。

1.7 Western blotting法檢測(cè)Bcl－2、Bax及p53的表達(dá) 將H8接種于25 cm培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁后換液，加入黃芪注射液，使其終濃度分別為100、200、500、1 000 g/L。未加藥物的為空白對(duì)照組。常規(guī)收集經(jīng)不同濃度藥物處理48 h的細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)后，加入20 μl上樣緩沖液。煮沸5 min后，在SDS－聚丙烯酰胺凝膠 (SDS－PAGE)上進(jìn)行電泳。每孔加入20 μl樣品，加適量1×電泳緩沖液，接好正負(fù)電極。開始設(shè)為90 V恒壓，觀察marker的移動(dòng)情況，電泳至分離膠底部時(shí)，終止電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯 (PVDF)膜上，封閉1 h以上，分別加入1∶400稀釋的兔抗人Bcl－2、Bax單克隆抗體和1∶1 000稀釋的兔抗人p53單克隆抗體。搖床上4℃雜交過夜。取出PVDF膜，用TBST洗3次，5 min/次。再放入裝有1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG－HRP的15 ml離心管中，搖床上雜交1 h。取出PVDF膜，用TBST洗3次，5 min/次。倒掉洗膜液，吸去多余液體，鋪于玻璃板上。將ECL試劑盒內(nèi)的detection reagent 1與detection reagent 2等體積混合后，均勻滴在PVDF膜上，反應(yīng)1～2 min。上機(jī)檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以 ()表示，多組間比較采用單因素方差分析、析因分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪注射液對(duì)H8體外的增殖抑制作用 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的黃芪注射液對(duì)H8都有一定的抑制作用，且呈時(shí)間和濃度的依賴性，各組細(xì)胞抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F組間=4.782，F(xiàn)時(shí)間=5.539，P＜0.05，見圖1)。

2.2 黃芪注射液對(duì)H8凋亡的影響 Annexin V－FITC/PI法檢測(cè)結(jié)果顯示，4種濃度的黃芪注射液均可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。經(jīng)黃芪注射液干預(yù)48 h，凋亡率分別為空白對(duì)照組 (4.492±1.084)%、100 g/L組 (18.054±1.108)%、200 g/L組(29.368±1.115)%、500 g/L組 (37.090±2.652)%、1 000 g/L組 (54.614±3.052)%，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=3.782，P＜0.05，見圖2)。

2.3 Western blotting檢測(cè)Bcl－2、Bax、p53的表達(dá) 不同濃度的黃芪注射液 (100、200、500、1 000 g/L)干預(yù)48 h后，Bcl－2在空白對(duì)照組的表達(dá)量最高，在實(shí)驗(yàn)組隨著藥物濃度的增加Bcl－2的表達(dá)量逐漸減少。Bax、p53在對(duì)照組的表達(dá)量最低，在實(shí)驗(yàn)組隨著藥物濃度的增加Bax、p53的表達(dá)量逐漸增加 (見圖3)。

3 討論

宮頸癌近幾年的發(fā)病逐漸呈現(xiàn)了年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了女性的健康，其發(fā)病是由宮頸癌前病變逐漸衍變而來的。因此，控制癌前病變階段的發(fā)展成為預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。

圖1 黃芪注射液對(duì)H8的抑制率Figure 1 Inhibition rate on H8 cells with astragalus membranaceus injection

圖2 H8經(jīng)黃芪注射液處理48 h的流式圖Figure 2 FCM showed effect of astragalus membranaceus injection on apoptosis of H8 cells after 48 h

圖3 Western blotting法檢測(cè)Bcl－2、Bax、p53的表達(dá)Figure 3 Expression of apoptosis related protein Bcl－2，Bax and p53 detected by western blotting

經(jīng)大量研究證明，宮頸癌的發(fā)生與高危型HPV的持續(xù)、慢性感染密切相關(guān)，其中以HPV16/18型最多見［5］。H8是用含HPV16 E6/E7基因的rAV轉(zhuǎn)染胎兒宮頸上皮細(xì)胞獲得的，該細(xì)胞可以在體外無限傳代，但其本身不具有致瘤性。所以該細(xì)胞系可以作為宮頸癌前病變的體外研究模型［6－7］。

黃芪在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史，相關(guān)研究一直受到人們的廣泛關(guān)注［8－9］。國(guó)內(nèi)外研究表明，黃芪及其提取物的有效成分通過抑制某些腫瘤細(xì)胞 (宮頸癌、結(jié)腸癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、乳腺癌、胃癌)的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而具有一定的抗癌作用［10］。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)，結(jié)果顯示黃芪注射液能夠明顯抑制H8的體外增殖，并且呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴關(guān)系。這與樊占兵等［11］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Annexin V－FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡表明，H8經(jīng)不同濃度的黃芪注射液處理48 h后，發(fā)生了不同程度的凋亡且隨著藥物濃度的增加凋亡率逐漸增高。因此表明黃芪注射液可以誘導(dǎo)H8的凋亡。所以可以推測(cè)黃芪注射液對(duì)H8的體外增殖抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。Western blotting法檢測(cè)Bcl－2、Bax、p53表達(dá)量表明，隨著藥物濃度的增加Bcl－2的表達(dá)量逐漸減少，Bax、p53的表達(dá)量逐漸增加，可以推測(cè)黃芪注射液誘導(dǎo)H8的凋亡與Bcl－2的表達(dá)量逐漸減少，Bax、p53的表達(dá)量逐漸增加有關(guān)［12］。這與徐經(jīng)安等［13］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。但是不同的細(xì)胞株對(duì)黃芪注射液的敏感度有所不同，這可能與不同細(xì)胞株之間的分子生物學(xué)差異有關(guān)系。

本研究結(jié)果可以為臨床上感染高危型HPV和宮頸癌前病變的治療提供一定的理論依據(jù)以及為中藥防治宮頸癌提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)表明黃芪可以通過抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以及誘發(fā)凋亡作為一種防癌藥物在臨床中得以應(yīng)用。但是具體是黃芪中的哪種有效成分具有防癌作用還有待于進(jìn)一步研究和探討。

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