（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸外科，沈陽110032）

人肺腺癌中RhoA的表達及臨床意義

徐寶寧，姜文軍，田大力
（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸外科，沈陽110032）

目的檢測人肺腺癌組織及其對應(yīng)的癌旁肺組織中RhoA的表達，研究RhoA與肺腺癌發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討其在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法選取有完整臨床資料的30例肺腺癌組織和30例對應(yīng)的癌旁肺組織，應(yīng)用實時PCR方法檢測2組中RhoA mRNA的表達情況。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示：在30例肺腺癌組織中26例（86.7%）RhoA mRNA表達水平明顯高于對應(yīng)的癌旁肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RhoA mRNA表達與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)論RhoA mRNA表達可能與肺腺癌的發(fā)生有關(guān)，參與了肺腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移，有望作為肺腺癌預(yù)后和轉(zhuǎn)移指標(biāo)。

RhoA；肺腺癌；侵潤轉(zhuǎn)移；實時PCR

肺腺癌已成為最常見的肺癌類型，而且也是非吸煙人群中最常見的肺癌類型［1］。近年來隨著環(huán)境污染的加重，肺腺癌的發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢［2］。RhoA是小分子G蛋白Rho家族成員之一，參與細胞骨架的組裝、細胞黏附、細胞運動、細胞周期進展、細胞分裂及基因轉(zhuǎn)錄等多種生命過程的調(diào)節(jié)［3］。多項研究已經(jīng)證實Rho家族成員在胃癌、肝癌、食管癌、卵巢癌等多種癌組織中存在過度表達，并且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4～7］。本研究采用實時PCR法檢測肺腺癌組織及其對應(yīng)的癌旁肺組織中RhoA mRNA的表達水平，探討其在人肺腺癌組織及對應(yīng)的癌旁肺組織中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

30例肺腺癌組織及30例對應(yīng)的癌旁肺組織標(biāo)本均來自2008-2011年于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院接受肺癌切除術(shù)的患者。其中男性12例，女性18例，年齡36～73歲，平均60歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟肺癌的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期6例，Ⅱ期14例，Ⅲ期10例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的22例。所有病例均為初發(fā)，臨床病理資料完整，患者術(shù)前均未接受放、化療。

1.2 主要試劑

RhoA及GAPDH引物片段、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量PCR反應(yīng)試劑盒均購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 實驗方法

術(shù)中取得標(biāo)本離體后放入液氮中保存，再轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存。實時PCR引物序列通過Gen-

Bank查找全序列，Primer5.0軟件自行設(shè)計。RhoA引物序列：上游5′-TGATTGTTGGTGATGGAGCCT-3′，下游5′-ACTCTACCTGCTTTCCATCCAC-3′，產(chǎn)物片段長138 bp。由人GAPDH作為內(nèi)參照進行定量分析，GAPDH引物序列：上游5′-GGTGGTCTCCT CTGACTTCAACA-3′，下游5′-GTTGCTGTAGCCAA ATTCGTTGT-3′，產(chǎn)物片段長127 bp。總RNA的提?。喝?0 g標(biāo)本，按寶生物總RNA提取試劑盒進行操作，提取后將總RNA溶解于DEPC水（15～40 μL）中，-80℃保存。cDNA的合成：根據(jù)提取的RNA濃度取RNA 500 ng，配制成10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（5× PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL）。以37℃15 min孵育，80℃5 s終止反應(yīng)，4℃保存，-20℃長期保存。使用ABI7300實時定量PCR儀進行聚合酶鏈反應(yīng)：20 μL反應(yīng)體系（10 μL SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL RhoA或GAPDH上游引物，0.4 μL RhoA或GAPDH下游引物，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cNDA，6.8 μL dH2O），反應(yīng)條件：階段1：95℃30 s，1個循環(huán)；階段2：95℃5 s，60℃31 s，40個循環(huán)；添加溶解曲線：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s?；虻南鄬Α鰿t=Ct目的基因-Ct內(nèi)參。相對表達量的計算采用2-△△Ct法。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料用x± s表示，采用配對樣本t檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoA mRNA在肺腺癌及癌旁肺組織中的表達

實時PCR結(jié)果顯示：在30例肺腺癌組織中，26例（86.7%）RhoA mRNA表達水平（0.049 236±0.022 896）明顯高于對應(yīng)的癌旁肺組織（0.006 275±0.003 167），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實時定量PCR具體溶解曲線及擴增曲線，見圖1。

2.2 RhoA mRNA的表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

RhoA mRNA的表達水平在不同臨床分期中不同，肺癌Ⅱ、Ⅲ期患者（0.062 746±0.031 963）的表達水平顯著高于Ⅰ期患者（0.004 258±0.002 286），N1+ N2組患者（0.082 776±0.045 962）的表達水平明顯高于N0組患者（0.007 845±0.003 298），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 擴增曲線及溶解曲線Fig.1 The amplification curve and dissociation curve

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率已躍居各類惡性腫瘤的首位，肺腺癌已成為最常見的肺癌類型，而且也是非吸煙人群中最常見的肺癌類型，男性患者的比例也呈上升趨勢。其中腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的最主要因素，這個過程涉及到多種細胞因子、黏附分子及基質(zhì)蛋白酶的改變。

Rho蛋白是一種具有GTP酶活性的小分子G蛋白，主要包括Rho、Rac、Cdc42三個亞家族，至少包括23個成員，RhoA是小分子G蛋白Rho家族成員之一，參與細胞骨架的組裝、細胞黏附、細胞運動、細胞周期進展、細胞分裂及基因轉(zhuǎn)錄等多種生命過程的調(diào)節(jié)［3］。多項研究已經(jīng)證實Rho家族成員在胃癌、卵巢癌、直腸癌、口腔鱗狀細胞癌等多種癌組織中存在過度表達，并且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4～7］。有研究報道，應(yīng)用小干擾RNA沉默RhoA和RhoC表達，構(gòu)建重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染進入人的乳腺癌細胞株，觀察重組質(zhì)粒對細胞的影響，實驗顯示重組質(zhì)粒對抑制癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移有效［8］。本研究顯示，在30例肺腺癌組織中，26例（86.7%）RhoA mRNA表達水平明顯高于對應(yīng)的癌旁肺組織。RhoA的表達與腫瘤的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況有密切聯(lián)系。RhoA mRNA表達在不同TNM分期有顯著差異，隨著肺腺癌臨床分期的增高，RhoA的表達也增加，在Ⅱ、Ⅲ期患者的表達水平明顯高于Ⅰ期，根據(jù)此結(jié)果可推測RhoA參與了肺腺癌的發(fā)生過程。N1+N2組患者的表達水平明顯高于N0組，表明RhoA的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切聯(lián)系，提示RhoA參與了肺腺癌的發(fā)生過程，RhoA高表達可

促進肺腺癌細胞的侵襲性，為以后應(yīng)用RhoA作為評估肺腺癌惡性程度、轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)提供了理論依據(jù)。RhoA mRNA高表達可能與肺腺癌的發(fā)生有關(guān)，參與了肺腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移，有望作為肺腺癌預(yù)后和轉(zhuǎn)移指標(biāo)。

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（編輯陳姜）

Expression and ClinicalSignificanceof RhoA in Human Lung Adenocarcinoma

XUBao-ning，JIANGWen-jun，TIANDa-li
（DepartmentofThoracic Surgery，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo determine different expression of RhoA mRNA in human lung adenocarcinoma tissues，investigate the correlation of RhoA with the occurrence，invasion，and metastasis of lung adenocarcinoma，and discuss its role in occurrence and development of lung adenocarcinoma.MethodsRhoA mRNA expression in 30 cases of lung adenocarcinoma tissues and their corresponding normal tissues were analyzed，using quantitative real-time PCR.ResultsOur results showed that among 30 lung adenocarcinoma tissues，26（86.7%）exhibited higher levels of RhoA mRNA compared with their corresponding normal tissues，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.RhoA mRNA expression was associated with clinicalpathologicalstage，and lymph node metastasis.ConclusionRhoA mRNAexpression may be correlated to the occurrence of lung adenocarcinoma.It was involved in the invasion and lymph node metastasis of lung adenocarcinoma，which may be expected as an indicator for metastasis oflung adenocarcinoma and an predictorofprognosis.

RhoA；lung adenocarcinoma；invasion and metastasis；real-time PCR

R734.2

A

0258-4646（2014）01-0049-03

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2013408001）

徐寶寧（1964-），男，副主任醫(yī)師，博士. E-mail：johonei@sina.com

2013-11-22

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