何平，李紅，李德天，馮國和

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院1.腎內科；2.心內科；3.感染科，沈陽 110004）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球范圍內重要的公共衛(wèi)生問題之一。據估計全球范圍內有3.5億人是慢性HBV攜帶者［1］。長期以來中國、東南亞和熱帶非洲為高流行區(qū)。自1971年Combes等首先描述了第1例具有持續(xù)HBsAg血癥的患者發(fā)生了膜性腎病（MN）以來，腎小球腎炎已被公認為是HBV感染引起的最常見肝外病變，又稱乙型肝炎病毒相關性腎炎（HBV?associated glomerulo?nephritis，HBVGN）。既往認為，HBVGN的發(fā)病機制是HBV抗原和抗體形成的循環(huán)免疫復合物和原位免疫復合物在腎組織的沉積。但目前認為，HBV因其泛嗜性而直接感染腎組織細胞，產生病毒的殺細胞效應，也是HBVGN重要的發(fā)病機制之一，同時也是使用核苷類藥物的理論基礎［2］。

既往認為，HBVGN以腎小球損害為主，但近年腎小管—間質損害也日益引起重視。腎小管上皮細胞凋亡與增殖之間的不平衡可能是導致HBVGN中腎小管萎縮和腎功能惡化的重要機制之一［3］。在針對HBVGN患者腎穿刺病理研究中，發(fā)現(xiàn)HBVGN患者腎組織中凋亡細胞明顯增多。腎小管的凋亡細胞明顯多于腎小球，多數分布于近端、遠端腎小管及集合管上皮細胞，腎間質也有少量凋亡細胞分布。同時凋亡相關蛋白Bax/Bcl?2也發(fā)生了相應的變化［4，5］。證實了腎小管上皮細胞凋亡也是HBVGN重要的病理改變之一。但HBVGN中腎小管上皮細胞凋亡的機制并不明確。HBx基因是HBV基因組中最小的開放性編碼框，編碼長度為154個氨基酸的蛋白。現(xiàn)已知HBx是一種多功能蛋白，具有反式激活功能，在培養(yǎng)細胞中表達后，它可在細胞質刺激信號轉導途徑和細胞核內的轉錄因子起到轉錄激活作用參與宿主細胞增殖或凋亡過程［6～9］。HBx在HBVGN發(fā)病中的作用和機制目前已成為HB?VGN發(fā)病機制研究中的熱點問題之一［10～12］。張瑜等［13］將HBx真核表達載體轉染至足細胞，發(fā)現(xiàn)HBx基因可抑制足細胞的增殖并促進其凋亡。但HBx基因對腎小管上皮細胞增殖及凋亡的影響，國內尚未見報道。

在本研究中，我們通過構建HBx基因真核表達載體，研究其對體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞（HK?2）的生物學行為的影響及可能機制，為進一步深入研究HBx基因在HBVGN發(fā)病機制中的作用打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒及細胞株

質粒pCDNA3.1?HBx由本室構建、保存。HK?2細胞株購自北京中原公司（美國ATCC中國大陸總代理）。

1.2 主要試劑

兔抗HBx單克隆抗體購自Chemicon公司；Bcl?2、Bax多克隆抗體購自Santa Cruz公司。CCK8及AnnexinV/PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 質粒轉染、實驗分組

采用脂質體轉染法，應用Li PofectamineTMLTX＆PLUSTM轉染試劑（美國Invitrogen公司），按照說明書步驟進行轉染。在實驗中，應用與PcDNA3.1（+）HBx大小接近的PEGFP?C1熒光質粒共轉染，評估目的質粒轉染效率。將培養(yǎng)瓶中生長處于對數生長期的腎小管上皮細胞接種在24孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL，細胞數約1×105μL。次日清晨觀察培養(yǎng)板中的細胞生長良好，達到80%～90%融合。根據質粒及轉染試劑比例不同，設置3個組別。第1組：1 μ g質粒+2 μL PLUS∶2 μL LTX；第2組：1 μg質粒+2 μ L PLUS∶3 μL LTX；第3組：1 μg質粒+2 μL PLUS∶4 μ L LTX。24 h后，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。每孔隨即取10個視野，在同個視野內通過將熒光跟白光對比，然后細胞計數，按熒光/白光細胞數×100%得出轉染效率。

細胞實驗分5組：（1）對照組（control）；（2）轉染空質粒PCDNA3.1（+）組（PCDNA3.1+）；（3）轉染質粒PCDNA3.1（+）HBx 24 h組（24 h）；（4）轉染質粒PCDNA3.1（+）HBx 48 h組（48 h）；（5）轉染質粒PCD?NA3.1（+）HBx 72 h組（72 h）。

1.4 免疫細胞化學

各組細胞在蓋玻片上生長融合達到85%～95%時，從孵箱中取出。用PBS洗后，4%的甲醛固定。0.5%Triton X?100 37℃溫箱透化20 min。血清封閉后，分別加一抗 Bcl?2（1∶160）、Bax（1∶320）濕盒里，4℃過夜。PBS洗后，加相應二抗。滴加生物素酶后，DAB顯色，蘇木素復染，返藍。脫水、透明、封片、觀察。

1.5 Western印跡

實驗各組細胞胰酶消化，收獲細胞后，用含有PMSF的RIPA裂解液提取細胞總蛋白。細胞提取物用BCA法測定濃度。等量上樣，用12%的SDS?PAGE凝膠電泳分離。之后將蛋白轉移至PVDF膜上。封閉后，分別加入一抗：HBx（1∶1 000，Chemicon公司）、Bcl?2（1∶500，Santa Cruz公司）、Bax（1∶1 000，Santa Cruz公司），4℃搖床孵育過夜。加入相應二抗，進行ECL反應。一次性完成定影、顯形、圖像分析系統(tǒng)測定條帶的灰度值。

1.6 細胞增殖測定

CCK8法檢測HBx基因對HK?2細胞增殖的抑制作用。消化收集細胞并接種于3張96孔板。接種過夜后，分別為對照組、轉染空質粒組、轉染PCD?NA3.1（+）HBx組。細胞在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。結束培養(yǎng)前2 h每孔加CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標儀檢測波長450 nm的每孔光密度值（OD值）。細胞生存率、增殖抑制率按如公式計算：生存率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%，抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.7 細胞凋亡測定

對數生長期HK?2細胞接種于6孔板，后轉染空質粒及PCDNA3.1（+）HBx，分別于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，直接在倒置顯微鏡下觀察。

應用AnnexinV?FITC/PI雙標記流式細胞術定量檢測各組細胞凋亡。用無EDTA胰酶消化收集各組細胞。離心、PBS洗滌細胞3次。用500 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106/mL。在細胞懸浮液中加入5 μL AnnexinV?FITC輕輕混勻，4℃冰箱避光孵育30 min。加入5 μL PI后輕輕混勻4℃避光條件下孵育5 min。隨即用流式細胞儀上機檢測（最遲1 h內）。結果用Cellquest專業(yè)軟件獲取分析數據。AnnexinV?FITC/PI雙標記流式細胞術可將實驗樣本中正常、壞死、凋亡細胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光作雙參數點圖，細胞分為4個象限，左下象限：AnnexinV?FITC?、PI?，代表正?；罴毎?；左上象限：AnnexinV?FITC?、PI+，代表機械損傷細胞；右下象限：AnnexinV?FITC+、PI?，代表早期凋亡細胞；右上象限：AnnexinV?FITC+、PI+，代表晚期凋亡/壞死細胞。分別計數各組細胞凋亡率并進行組間比較。

1.8 統(tǒng)計學分析方法

2 結果

2.1 目的質粒PCDNA3.1（+）HBx的轉染效率評估

通過PEGFP?C1的轉染效率評估PCDNA3.1（+）HBx的轉染效率，可見第3組轉染效率最高，大概為40%～60%，后續(xù)實驗按照此孔量進行轉染。結果見圖1。

圖1 各組轉染效率比較 ×100Fig.1 Comparison of transfection efficiency in each group×100

2.2 HBx基因轉染后在HK?2細胞中的表達

轉染PCDNA3.1（+）HBx 24 h、48 h及72 h組在預期的17 kDa出現(xiàn)一條明顯條帶。表明HBx基因在HK?2細胞得到了表達。轉染目的基因24 h及48 h，蛋白表達量無明顯區(qū)別（P＆gt;0.05）。轉染目的基因72 h后，蛋白表達水平最高，與24 h、48 h比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）?？蛰d體轉染及未轉染組未見相應蛋白條帶，結果見圖2。

2.3 轉染HBx基因后，凋亡相關蛋白Bax/Bcl?2比值顯著增高

細胞免疫化學方法檢測各組細胞Bcl?2、Bax表達。Bcl?2在各組細胞中均有表達。在對照組、轉染空質粒組均呈高水平表達，兩組之間無統(tǒng)計學差異（P＆gt;0.05）。轉染Pc?DNA3.1（+）HBx 24 h后，Bcl?2表達水平開始下降，Bax表達水平明顯上升，Bax/Bcl?2比值顯著增高，至轉染后72 h，升至最高。轉染Pc?DNA3.1（+）HBx各組間及與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05），見圖3，圖4。

WB方法檢測Bcl?2、Bax表達。在對照組、轉染空質粒組均呈較高水平表達，2組之間無統(tǒng)計學差

異（P＆gt;0.05）。轉染Pc?DNA3.1（+）HBx 24 h后，Bcl?2表達水平開始下降，Bax表達水平開始增加，Bax/Bcl?2比值顯著增高，至轉染后72 h，升至最高。轉染Pc?DNA3.1（+）HBx各組間及與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05），見圖5、圖6。

圖3 對照組、轉染空質粒組及轉染HBx 24 h、48 h、72 h后各組細胞免疫化學Bcl?2表達 ×200Fig.3 Immunohistochemical analysis of Bcl?2 expression in the each group ×200

圖4 對照組、轉染空質粒組及轉染HBx 24 h、48 h、72 h后各組細胞免疫化學Bax表達 ×200Fig.4 Immunohistochemical analysis of Bax expression in each group×200

2.4 轉染HBx基因后，對HK?2細胞增殖抑制作用

轉染空質粒組細胞存活率與對照組無明顯差別（P＆gt;0.05），提示對細胞無明顯增殖抑制作用。轉染PCDNA3.1（+）HBx24 h后，對細胞的增殖有明顯抑制作用，達到（14.08±2.14）%，與對照組相比，差異具有顯著性（P＆lt;0.05）。轉染PCDNA3.1（+）HBx 48 h后，細胞的增殖抑制率顯著增加，達到（31.33±2.24）%，與對照組、轉染PCDNA3.1（+）HBx24 h比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。轉染72 h后，細胞的增殖抑制率達到（35.27±1.10）%，與對照組、轉染PCDNA3.1（+）HBx 24 h比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）；但與轉染48 h比較無明顯差異（P＆gt;0.05）。

2.6 轉染HBx基因后，引起HK?2細胞凋亡

倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化。對照組細胞及轉染空質粒組細胞密度較大，形態(tài)基本正常；而轉染PCDNA3.1（+）HBx后各時間點各組出現(xiàn)細胞增殖受抑，細胞密度變?。坏蛲黾毎捏w積變小、變圓，細胞出現(xiàn)皺縮、脫落，見圖7。

圖5 各組細胞Bcl?2、Bax的Western?blot條帶Fig.5 Western blot bands of Bcl?2 and Bax in each group

圖6 各組細胞Bax/Bcl?2比值Fig.6 The ratio of Bax/Bcl?2 in each group

圖7 倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài) ×100Fig.7 Cell morphology in each group using inverted microscope×100

流式細胞儀檢測HBx基因對細胞凋亡的影響。對照組HK?2細胞凋亡率為（5.82±1.62）%；轉染空質粒組細胞凋亡率為（5.91±1.09）%；轉染PCD?NA3.1（+）HBx 24 h組細胞的凋亡率為（15.12±1.98）%；轉染PCDNA3.1（+）HBx 48 h組細胞的凋亡率（21.62±2.23）%；PCDNA3.1（+）HBx 72 h組細胞的凋亡率為（23.80±2.16）%。轉染空質粒組凋亡率較對照組無明顯變化。轉染PCDNA3.1（+）HBx后各組細胞的凋亡率較對照組凋亡率均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。轉染48 h較轉染24 h組凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。但轉染48 h與轉染后72 h無統(tǒng)計學差異，見圖8、圖9。

圖8 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率Fig.8 Apoptosis rates in each group as determined by flow cytometry

圖9 各組細胞凋亡率比較柱狀圖Fig.9 Comparison of the apoptosis rates in each group

3 討論

HBVGN是中國兒童繼發(fā)性腎臟損害最常見的病因［14］，近年來研究報道HBV相關核酸分子在腎組織的存在和意義，發(fā)現(xiàn)HBVGN患者腎臟中存在HBV?DNA，HBV?RNA 和閉合環(huán)狀雙鏈DNA（cccD?NA），甚至完整的病毒顆粒［15～17］，進一步支持了HBV可直接感染腎臟并原位復制而致病的觀點。

本實驗成功構建了HBx基因的真核表達載體PCDNA3.1（+）HBx，為進一步研究HBx對腎臟固有細胞的作用及其在HBVGN發(fā)病中的作用和意義奠定了重要基礎。

現(xiàn)有的研究表明，HBx蛋白與細胞凋亡有密切關系。然而，針對不同種類的細胞及不同的外界條件，HBx調節(jié)細胞凋亡的作用及機制也各不相同［18］。HK?2細胞是正常人近端腎小管上皮細胞株，具有人類腎小管上皮細胞的標志及生理、生化特性本研究以體外培養(yǎng)的HK?2細胞株為研究對象，通過應用CCK8、透射電鏡及流式細胞儀等檢測方法探討HBx基因對HK?2增殖和凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn)，轉染HBx基因后，抑制了HK?2細胞的增殖、促進了其凋亡。在轉染后72 h，HK?2細胞凋亡率最高。我們的研究證明了HBx基因可以導致體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡，從而更深入研究凋亡相關蛋白Bax及Bcl?2的表達。

細胞凋亡是由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序而導致的細胞程序性死亡，是從細胞外信號—細胞內信號通路—凋亡相關基因和酶的復雜過程［19］。研究表明，多種腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展除與細胞凋亡有著密切關系外，還伴隨著凋亡相關基因表達的變化［20，21］，Bcl?2家族的成員是細胞凋亡整合期決定細胞生存和死亡信號至關重要的整合因子，其中Bcl?2是一種抗凋亡蛋白；而Bax與Bcl?2的作用相反，是一個典型的促凋亡蛋白。因此Bax和Bcl?2二者的表達水平及Bax/Bcl?2比值則成為影響細胞生存的重要因素。Bax/Bcl?2比值增高決定了細胞走向死亡并進入細胞凋亡的執(zhí)行期，通過一系列復雜的級聯(lián)反應及細胞內的信號傳導途徑導致細胞的凋亡［22］。在糖尿病腎病和梗阻性腎病動物模型中已檢測到凋亡蛋白Bax/Bcl?2的異常表達。在原發(fā)性腎臟疾病患者的腎組織中也發(fā)現(xiàn)Bax的表達隨腎小管間質病變的加重而增加。環(huán)孢素A所致腎毒性機制研究及實驗性腎小管壞死（ATN）模型中，發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞Bax表達增加［23］。在急性腎小管排異的研究中發(fā)現(xiàn)小管上皮細胞Bcl?2表達水平下降，Bax表達水平上升，同時伴隨細胞凋亡的增加。提示凋亡相關基因Bcl?2和Bax在原發(fā)和繼發(fā)性腎臟疾病的進展中起著重要作用。孫莉靜等［4］分析HBV?GN患者腎臟病理資料時發(fā)現(xiàn)，HBV?GN患者較對照組腎細胞凋亡指數明顯增加，凋亡細胞多分布于近端、遠端腎小管及集合管上皮細胞。HBV?GN患者Bcl?2主要在腎小管上皮細胞表達；Bax在腎小球、腎小管均有表達，與對照組相比，Bax表達水平明顯上升。提示在HBVGN中，伴隨著凋亡細胞增加，凋亡相關蛋白Bax及Bcl?2表達水平也發(fā)生了相應的變化。

本實驗結果顯示，轉染HBx基因24 h后，Bcl?2表達水平顯著下降，Bax水平顯著增加，Bax/Bcl?2比值明顯增高，細胞凋亡率顯著增加，與孫莉靜［4］等人的HBVGN臨床病理研究結果是一致的。本實驗有助于對HBVGN中腎小管上皮細胞細胞凋亡相關作用機制的闡明；進一步證明了HBx基因通過上調Bax/Bcl?2比值，引起腎小管上皮細胞凋亡；同時豐富了HBVGN發(fā)病機制中HBV直接損傷的致病理論。本實驗是以永生細胞株為研究對象，故進一步深入研究仍待繼續(xù)。

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