馬利華，秦衛(wèi)東，陳學(xué)紅，朱蒙蒙

（徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州221008）

槐花蛋白萃取與營養(yǎng)評(píng)價(jià)的研究

馬利華，秦衛(wèi)東*，陳學(xué)紅，朱蒙蒙

（徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州221008）

采用響應(yīng)面對(duì)雙水相體系萃取槐花蛋白進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行營養(yǎng)評(píng)價(jià)?？疾炝薖EG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、萃取溫度等因素對(duì)槐花蛋白萃取率的影響，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行營養(yǎng)分析評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：最佳萃取條件為PEG4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%、pH5、萃取溫度50℃，槐花蛋白中必需氨基酸比例比較均衡，符合WHO/FAO的推薦標(biāo)準(zhǔn)，有較高的營養(yǎng)價(jià)值，極具開發(fā)利用價(jià)值。

槐花，蛋白質(zhì)，雙水相體系，營養(yǎng)評(píng)價(jià)

槐花是豆科植物槐（Sophora japonica L.）的花朵或花蕾[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、多種維生素，其中蛋白質(zhì)可與牛、羊肝、苦杏仁相媲美[2]。有研究表明，槐花具有清熱解毒、涼血潤肺、降血壓等功效[3-4]，許多食品工作者致力于對(duì)槐花中各種生物活性物質(zhì)的研究。

雙水相萃取體系是由兩種互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的鹽溶液和高分子溶液組成，聚乙二醇（PEG4000）與（NH4）2SO4形成的雙水相體系中，當(dāng)PEG的濃度大于其成相臨界點(diǎn)的濃度時(shí)，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，兩相性質(zhì)的差別增大，蛋白質(zhì)在兩相中的界面張力差別增大，使其趨于向一側(cè)分配，具有能耗較低，分離步驟少，不會(huì)引起生物活性物質(zhì)失活或變性，不存在有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[5]，近年來有一些相關(guān)研究報(bào)道，如張喜峰等[6]采用雙水相體系萃取分離葡萄酒下腳料中葡萄皮蛋白質(zhì)，蘇艷玲[7]采用PEG/（NH4）2SO4雙水相體系萃取杏鮑菇多糖，孫亞莉等[8]采用雙水相萃取紅豆蛋白質(zhì)等。以槐花為原料，雙水相法萃取蛋白質(zhì)的研究國內(nèi)還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以干槐花為原料，采用PEG/（NH4）2SO4雙水相體系，研究不同條件下萃取率，采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)對(duì)雙水相萃取槐花蛋白質(zhì)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行營養(yǎng)分析，為槐花中蛋白質(zhì)的高效充分提取，促進(jìn)槐花蛋白功能食品加工可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干槐花 市售；PEG4000、（NH4）2SO4、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、茚三酮 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 生化試劑，AIGMA。

分液漏斗 上海玻璃儀器有限公司；FZ101微型植物粉粹機(jī) 濟(jì)南翔科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；723型可見分光光度計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；L-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙水相萃取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效果的影響 分別取PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%、24%、26%、28%、30%、32%和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%的兩種溶液于小燒杯中，在pH 5、溫度50℃的條件下混勻分層，取0.5g的槐花粉末加入混勻分層的溶液中，攪拌均勻，萃取0.5h，抽濾，濾液倒入量筒中，靜置[9]，達(dá)到兩相分離。

分別?。∟H4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、35%、40%、45%、55%和PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的兩種溶液置于小燒杯中，在pH5、溫度50℃的條件下混勻分層，取0.5g的槐花粉末加入混勻分層的溶液中，攪拌均勻，萃取0.5h，抽濾，濾液倒入量筒中，靜置[9]，達(dá)到兩相分離。

1.2.1.2 pH對(duì)萃取效果的影響 取PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%的兩種溶液置于小燒杯中，分別在pH 3、4、5、6、7、8，溫度50℃的條件下混勻分層，取0.5g的槐花粉末加入混勻分層的溶液中，攪拌均勻，萃取0.5h，抽濾，濾液倒入量筒中，靜置[9]，達(dá)到兩相分離。

1.2.1.3 溫度對(duì)萃取效果的影響 PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效果的影響取PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%兩種溶液于小燒杯中，在pH 5、溫度分別在30、40、50、60、70、80℃的條件下混勻分層，取0.5g的槐花粉末加入混勻分層的溶液中，攪拌均勻，萃取0.5h，抽濾，濾液倒入量筒中，靜置[9]，達(dá)到兩相分離。

1.2.1.4 萃取率計(jì)算 在PEG-（NH4）2SO4雙水相體系中，（NH4）2SO4濃度的增高會(huì)使下相鹽析作用加強(qiáng)，下相中的槐花蛋白向上相轉(zhuǎn)移，并富集于上相，分別測定上下相蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算分配系數(shù)K及蛋白質(zhì)萃取率Y。計(jì)算公式如下：

式中，Vt、Vb上、下相體積；Ct、Cb為上、下相蛋白質(zhì)濃度（mg/m L）。

1.2.2 雙水相萃取中心組合實(shí)驗(yàn) 根據(jù)采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以萃取率為考察指標(biāo)，采用PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和溫度四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)選工藝。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factorsand levelsof response surfacemethodology table

1.2.3 蛋白質(zhì)測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[10]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0069x+ 0.015，相關(guān)系數(shù)R2=0.9981。

1.2.4 蛋白質(zhì)醇析 分離上相溶液，加入4倍體積的95%乙醇，靜置，棄去上層溶液，沉淀物4000r/m in離心10m in，沉淀物冷凍干燥，得到槐花蛋白。

1.2.5 氨基酸組成 參照GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的測定[11]。取干燥后的槐花蛋白粉碎過60目篩，準(zhǔn)確稱取均勻性好的試樣0.5g，置于水解管中，加鹽酸溶液（6moL/L）10～15m L，然后反復(fù)充入高純氮?dú)?，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口，置于110℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，冷卻。將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗，定容至100m L，溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后裝進(jìn)樣瓶，直接上氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

測定條件HITACHI L-8800全自動(dòng)高速氨基酸分析儀，W indows NT操作系統(tǒng)，陽離子交換樹脂分析柱3μm×4.6mm×60mm，測定波長570、440nm，分析時(shí)間為40m in，pH 2.2檸檬酸緩沖液流量0.4m L/m in，茚三酮流量0.3m L/m in，樣品進(jìn)樣量為10μL。

數(shù)據(jù)處理：使用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)樣品氨基酸組成及含量進(jìn)行分析和聚類分析。

1.2.6 氨基酸評(píng)分（Am inoaeidseore，AAS） 氨基酸評(píng)分為實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸占WFO/FAO評(píng)分模式中相應(yīng)氨基酸含量的百分比[12]。

式中：x—實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)某一必需氨基酸含量；s—WHO/FAO評(píng)分模式氨基酸含量。

1.2.7 化學(xué)評(píng)分（Chem iealseore，CS） 化學(xué)評(píng)分是采用FAO1970推薦的方法[13]，測定評(píng)價(jià)待測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸的相對(duì)含量（與其必需氨基酸總量之比）與標(biāo)準(zhǔn)雞蛋白中相應(yīng)必需氨基酸相對(duì)含量的接近程度，按下式計(jì)算：

式中：Ax待測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸的含量；Ae待測蛋白質(zhì)中必需氨基酸的總含量；Ex—標(biāo)準(zhǔn)雞蛋白中相應(yīng)必需氨基酸的含量；Ee—標(biāo)準(zhǔn)雞蛋白中必需氨基酸的總含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，均用Origin（V8.5.1）數(shù)據(jù)分析軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效果的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG4000濃度從22%上升至28%，槐花中上相蛋白質(zhì)的萃取率不斷的增加，當(dāng)PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%時(shí)，出現(xiàn)最大萃取率75.56%。說明當(dāng)成相的兩種物質(zhì)的濃度很大的時(shí)候，成相的兩種物質(zhì)分子之間的作用力將會(huì)增強(qiáng)，且體系的表面的張力將會(huì)增強(qiáng)，從而致使溶液中的溶質(zhì)會(huì)吸附在界面上，且溶液中的溶質(zhì)在兩相之間的傳遞及在兩相中的擴(kuò)散的阻力也會(huì)有很大程度的增強(qiáng)，從而目標(biāo)蛋白分子不易于進(jìn)入鹽相；另一個(gè)方面，PEG4000濃度過大，黏度增大，阻止相間分子轉(zhuǎn)移的能力增加，相界面張力也增加，因而分相的時(shí)間也就越會(huì)延長[14]。這與馮自立等的研究相同[15]。

2.2 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效果的影響

無機(jī)鹽的濃度影響蛋白質(zhì)的親疏水性和蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而影響蛋白質(zhì)在雙水相中的分配。（NH4）2SO4用量不同，上下相電位差不同，而電位差的大小直接影響到分配系數(shù)和萃取率[15]。圖2顯示，隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)的萃取率隨之增加，當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到45%（NH4）2SO4的飽和溶解度時(shí)，出現(xiàn)最大上相萃取率82.04%。

圖1 PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐花蛋白萃取率的影響Fig.1 Effect on extraction yield of Sophora japonica L.by different PEG4000massfraction

圖2 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)槐花蛋白萃取率的影響Fig.2 Effecton extraction yield of Sophora japonica L.by different（NH4）2SO4massfraction

2.3 pH對(duì)萃取效果的影響

在雙水相系統(tǒng)中，由于體系的pH變化能明顯地改變兩相的電位差，而且pH的改變還導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)的變化，即影響蛋白質(zhì)分子可離解基團(tuán)的離解度，從而改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)來影響分配。如體系pH與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差越大，蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻，pH的微小變化甚至可能使蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)改變2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[16]。由圖3可知，在固定其他條件不變，pH為3～8范圍內(nèi)，槐花蛋白萃取率隨pH的增大先增大后減小，在體系自身pH為5時(shí)達(dá)最大值84.05%。

圖3 pH對(duì)蛋白質(zhì)萃取效果的影響Fig.3 Effecton extraction yield of Sophora japonica L.by different pH

2.4 溫度對(duì)萃取效果的影響

溫度的變化影響物質(zhì)的成相濃度，影響其分配。實(shí)驗(yàn)表明，隨著溫度的升高，槐花蛋白的萃取率逐漸增加，這是由于溶液溫度上升后，分子運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，削弱了靜電排斥作用的影響，導(dǎo)致槐花蛋白項(xiàng)上相移動(dòng)，萃取率增加。當(dāng)溫度大于50℃之后，萃取率隨溫度的升高而逐漸減小，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于高溫引起蛋白質(zhì)部分失活，使槐花蛋白的萃取率減小。

圖4 溫度對(duì)槐花蛋白萃取效果的影響Fig.4 Effecton extraction yield of Sophora japonica L.by different temperature

2.5 雙水相萃取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸擬合，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。利用Design Expert軟件，通過對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=86.22-0.28A-2.48B+2.65C-1.06D-1.13AB+0.91AC-1.64AD+3.40BC-1.75BD+ 1.88CD-0.081A2-3.92B2-7.49C2-1.61D2，該方法的方差分析及顯著性檢驗(yàn)見表3。

圖5 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH交互對(duì)萃取效果影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface for effected of（NH4）2SO4massfraction，pH

由表3方差分析結(jié)果可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型極顯著（p＜0.001），且方程失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1618＞0.1），說明各因素值與響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型來函數(shù)化。相關(guān)系數(shù)R2=0.9326，校正決定系數(shù)R2adj=0.8648表明萃取率的預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較好的擬合度。各因素中（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、pH（C）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響，且交互作用也有較顯著的影響，說明（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH是槐花蛋白萃取實(shí)驗(yàn)中重要的控制因素，當(dāng)PEG4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%、溫度為50℃時(shí)，其交互作用的響應(yīng)曲面見圖5。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tabe 2 Box-Behnken experiment results

由二次多項(xiàng)回歸方程得到最佳萃取條件為：PEG4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%、pH 5、溫度50℃，萃取率達(dá)到理論最大值87.52%。采用上述優(yōu)化后的萃取條件對(duì)響應(yīng)面法進(jìn)行驗(yàn)證，共進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測得槐花蛋白質(zhì)平均萃取率為86.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的螯合工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，按照建立的模型進(jìn)行預(yù)測實(shí)際中是可行的。

2.6 槐花蛋白的營養(yǎng)評(píng)價(jià)

食品中蛋白質(zhì)、氨基酸種類和含量不一，其營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)劣主要取決于：a.是所含必需氨基酸的種類是否齊全；b.必需氨基酸數(shù)量的多少；c.各種必需氨基酸的組成比例[12]。氨基酸比值系數(shù)法給出了食品中必需氨基酸參考模式譜[13]。以人體各種必需氨基酸的比例作參考，食物蛋白質(zhì)的氨基酸組成越接近人體蛋白質(zhì)組成，并為人體消化吸收時(shí)，其營養(yǎng)價(jià)值越高。

表3 方差分析結(jié)果Tabe 3 Results of variance analysis

表4 槐花蛋白中氨基酸組成及含量Tabe 4 Composition and contents of amino acids in protein from Sophora japonica L.

表5 槐花蛋白中必需氨基酸含量及評(píng)分Tabe 5 Amino acid scores（AAS）and chemical scores（CS）in protein from Sophora japonica L.

由表4和表5可知，槐花中的氨基酸的含量非常豐富，種類齊全。必需氨基酸占總氨基酸的比值為34.24%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為52%。根據(jù)FAO/WHO的理想模式，質(zhì)量比較好的蛋白質(zhì)其氨基酸組成EAA/TAA為40%左右，EAA/NEAA為60%以上。由此可見，槐花蛋白中氨基酸組成略低于FAO/ WHO的理想模式，質(zhì)量較佳。從評(píng)分來看，根據(jù)氨基酸評(píng)分，槐花蛋白中Lys僅為80，為第一限制性氨基酸，苯丙氨酸和酪氨酸含量較高，其他接近FAO/WHO計(jì)分模式，說明槐花蛋白中必需氨基酸含量基本符合FAO/WHO模式，是一種優(yōu)良的植物蛋白源。

3 結(jié)論

由于雙水相萃取分離過程條件溫和、可調(diào)節(jié)因素多、易于放大和操作，是一種高效而溫和的生物分離技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)借助PEG/（NH4）2SO4雙水相體系萃取干槐花中蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行氨基酸組成分析。結(jié)果表明，最佳提取條件為：PEG4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%、pH 5、溫度50℃，槐花蛋白質(zhì)平均萃取率為86.68%。經(jīng)過分析得出，槐花蛋白中氨基酸組成基本符合FAO/WHO的理想模式，質(zhì)量較佳，是一種優(yōu)良的植物蛋白源，具有較高的開發(fā)價(jià)值。

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Study on extracted and nutritionalevaluation of protein from Sophora japonica L.

MA Li-hua，QINW ei-dong*，CHEN Xue-hong，ZHU M eng-meng
（College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China）

Response surface methodology（RSM）was used for op tim izating the extracting cond itions of p rotein from Sophora japonica L.in the p rocess of aqueose two-phase system s，and the nutritional value was evaluated.The d ifferent influencing fac tor were stud ied as PEG/（NH4）2SO4massfraction，pH，temperature，the nutritional evaluation was used by automatic am ino acid analyzer.The results showed that the op tim izating extracting conditions were 28%PEG4000，45% （NH4）2SO4，pH5，tem perature 50℃.All of the p rotein from Sophora japonica L.sam p les contained all kinds of essential am ino acids in a balanced p roportion，which was c lose to the recommended level by WHO/FAO.The development and utilization of it should be done for its higher nutritionalvalue.

Sophora japonica L.；p rotein；aqueose two-phase system s；nutritionalevaluation

TS201.1

B

1002-0306（2014）18-0301-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.059

2013－12－06 *通訊聯(lián)系人

馬利華（1966-），女，碩士研究生，副教授，研究方向：食品科學(xué)與加工。