陳二生，許學(xué)勤，許艷順，姜啟興

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料堿溶蛋白的制備工藝研究

陳二生，許學(xué)勤*，許艷順，姜啟興

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

以鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料為原料，采用酸堿法（pH-shifting）制備堿溶蛋白，主要探討原料的儲(chǔ)藏、提取pH、提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比以及沉淀pH對(duì)堿溶蛋白制備工藝的影響。結(jié)果表明，最佳提取pH為12.0，提取時(shí)間為15min，提取溫度為5℃，采用兩段式提取、提取料液比為1∶6（3+3），最佳沉淀?xiàng)l件為pH5.5，在此條件下，堿溶蛋白回收率約為82%。原料的不同處理對(duì)堿溶蛋白的制備無(wú)顯著影響。

鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料，酸堿法，堿溶蛋白

鰱魚(yú)是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的大宗淡水魚(yú)，由于多肌間刺，及風(fēng)味較差，因此鮮銷(xiāo)價(jià)格較低，一定程度上制約了這種魚(yú)的市場(chǎng)價(jià)值[1]。近年來(lái)，隨著淡水魚(yú)糜制備技術(shù)的發(fā)展，人們嘗試將鰱魚(yú)加工成魚(yú)糜，也取得到了一定成效。然而，鰱魚(yú)魚(yú)糜制備中的采肉過(guò)程會(huì)產(chǎn)生鮮魚(yú)總重約32%的下腳料[2]。到目前為止，這類(lèi)下腳料尚未得到很好利用，既造成了資源浪費(fèi)，也帶來(lái)環(huán)境污染壓力。

酸堿法（pH-shifting）提取動(dòng)物蛋白是國(guó)外學(xué)者發(fā)明的一種蛋白質(zhì)回收的技術(shù)[3-4]。該方法應(yīng)用于新鮮魚(yú)肉可獲得約80%的蛋白回收率[3-12]，而應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)加工下腳料時(shí)，蛋白回收率往往只有約50%[13-14]。這種差異主要是因?yàn)樾迈r魚(yú)肉蛋白質(zhì)中約90%為堿溶蛋白[15]，而魚(yú)體中的蛋白質(zhì)按對(duì)0.1mol/L NaOH的溶解性可分為堿溶蛋白和堿不溶蛋白部分[16]，其中堿溶蛋白部分具有良好的萃取性，采用酸堿法可以獲得較高的蛋白回收率；堿不溶蛋白部分80%以上為膠原蛋白[15]，較弱酸堿條件下難以溶解。魚(yú)類(lèi)加工下腳料蛋白質(zhì)中約40%為堿不溶蛋白[17]，采用酸堿法制備蛋白的回收率不高。為了提高蛋白回收率并對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料中的蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合利用，首先采用酸堿法對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料中的堿溶蛋白進(jìn)行制備，然后以剩余的沉淀為原料制備明膠，本文主要對(duì)堿溶蛋白的制備工藝進(jìn)行介紹。

在本工作中，主要研究了原料的儲(chǔ)藏、提取pH、提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比以及沉淀pH對(duì)堿溶蛋白制備工藝的影響，旨在為提高鰱魚(yú)魚(yú)糜加工副產(chǎn)品的附加值提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚(yú) 鮮活，體重3.0～4.0kg，購(gòu)于無(wú)錫雪浪市場(chǎng)；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、三氯乙酸（TCA）等常用化學(xué)試劑 均為分析純。

FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA基本型分散機(jī)（高速分散機(jī)） 上海施迪曼流體技術(shù)有限公司；SIGMA4K15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 北京亞力恩科學(xué)器材公司；DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；IKA電動(dòng)攪拌器 廣州市博勒泰貿(mào)易有限公司；YCR-180型魚(yú)糜采肉機(jī) 上海華夏漁業(yè)機(jī)械儀器工貿(mào)公司；其他 為實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料的制備及處理 新鮮鰱魚(yú)去頭、去鱗、去內(nèi)臟后，沖洗干凈，切成片狀然后立即通過(guò)魚(yú)糜采肉機(jī)，并收集采肉下腳料作為原料。然后，用高速組織搗碎機(jī)把下腳料處理成稠漿狀，封裝塑料袋中，并在不同條件下保存。-20℃條件下儲(chǔ)藏10h（標(biāo)記為A）；-20℃儲(chǔ)藏6個(gè)月（標(biāo)記為B）；-20℃儲(chǔ)藏1年（標(biāo)記為C）。提取前，下腳料用流動(dòng)的自來(lái)水解凍。

1.2.2 下腳料堿溶蛋白制備工藝流程 采用酸堿法（pH-shifting）制備鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料堿溶蛋白質(zhì)的工藝流程如下：采肉下腳料→取樣→加冰蒸餾水均質(zhì)→調(diào)pH→低溫?cái)嚢杼崛　谝淮坞x心分離→收集上清液、調(diào)pH至蛋白等電點(diǎn)使蛋白沉淀→第二次離心分離→沉淀（即為堿溶蛋白）。

1.2.3 制備工藝要點(diǎn)

1.2.3.1 原料 鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料，處理和儲(chǔ)藏條件同1.2.1所述。

1.2.3.2 提取 原料在恒定的溫度下在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)與提取液混合，均質(zhì)1m in，懸濁液放入大的燒杯中并采用IKA電動(dòng)攪拌器攪拌，攪拌的速度為200r/m in。在提取過(guò)程中根據(jù)需要加入2mol/L鹽酸或2mol/L氫氧化鈉，以保持提取液中pH的恒定。

1.2.3.3 離心 提取后把蛋白提取液轉(zhuǎn)移到塑料離心杯中，使用冷凍離心機(jī)（-20℃，10000×g，20m in）離心，收集上清液，記錄所得上清液的體積，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量，并計(jì)算蛋白的提取率。

1.2.3.4 等電點(diǎn)沉淀 取在最適提取條件下的蛋白離心上清液各50m L，分別加入2mol/L HCL或NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH（變化范圍：pH=1～11），然后-20℃條件下保持30min，保證蛋白質(zhì)能充分沉淀，然后使用冷凍離心機(jī)（-20℃，10000×g，20m in）離心，記錄所得上清液的體積，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算蛋白質(zhì)的沉淀率。

1.2.4 提取工藝條件的確定

1.2.4.1 提取pH的確定 取50g-20℃條件下保存10h的下腳料勻漿，固定料液比為1∶9，提取溫度10℃，提取時(shí)間10m in。分別將勻漿液的pH調(diào)節(jié)至2、3、4、5、5.5、6、7、8、9、10、11、12，然后進(jìn)行提取并分別測(cè)定對(duì)應(yīng)pH提取液的提取率。

1.2.4.2 提取時(shí)間的確定 取50g-20℃條件下保存10h的下腳料勻漿，提取pH為前面步驟所確定，固定料液比為1∶9，提取溫度10℃。測(cè)定在不同提取時(shí)間的提取率（提取時(shí)間變化范圍：5～60min）。

1.2.4.3 提取溫度的確定 取50g-20℃條件下保存10h的下腳料勻漿，提取液pH、提取時(shí)間為前面步驟所確定，固定料液比為1∶9。測(cè)定在不同提取溫度的提取效果（提取溫度變化范圍：5～30℃）。不同溫度所得離心上清液中加入50%三氯乙酸（TCA）使上清液中TCA濃度最終達(dá)到10%，在離心機(jī)中以10000×g離心20min，上清液部分為非蛋白氮，沉淀部分為蛋白質(zhì)，總上清氮、蛋白質(zhì)氮和非蛋白質(zhì)氮含量測(cè)定均采用凱氏定氮法。

1.2.4.4 提取料液比的確定 取50g-20℃條件下儲(chǔ)藏10h的下腳料勻漿，提取液pH、提取時(shí)間、提取溫度為前面步驟所確定。分別采用兩種方式進(jìn)行提取，一段式：在提取時(shí)間內(nèi)僅進(jìn)行一次提取，然后把提取液轉(zhuǎn)移到塑料離心杯中，使用冷凍離心機(jī)（-20℃，10000×g，20min）離心，丟棄沉淀，收集上清液；兩段式：在提取時(shí)間內(nèi)進(jìn)行兩次提取，第一次提取離心后的沉淀，再次用新鮮的提取液進(jìn)行二次提取，并合并兩次提取所得的上清液。兩段式每次提取時(shí)間為一段式的一半。測(cè)定在不同料液比的提取率，一段式（料液比變化范圍：1∶3～1∶15），兩段式[料液比變化范圍：1∶4（3+1）～1∶8（4+4），其中1∶4（3+1）表示兩段式第一次提取的料液比為1∶3，第二次提取的料液比為1∶1，總提取料液比為1∶4]。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 基本理化指標(biāo)的測(cè)定 水分、脂肪、蛋白和灰分含量采用AOAC方法進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.3.2 蛋白組分的測(cè)定 鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料蛋白質(zhì)組分的分離測(cè)定參照Wonnop Visessanguan等方法[16]，并略加改進(jìn)。具體方法如下：取下腳料勻漿100g，加入10倍體積的0.1mol/L NaOH連續(xù)攪拌提取8h，離心（10000×g，20m in），上清液中的蛋白為堿溶蛋白，沉淀部分的蛋白為堿不溶蛋白。上清液中的堿溶蛋白調(diào)節(jié)pH至7.0，冷凍干燥后得堿溶蛋白。

堿溶蛋白組分離測(cè)定如下：取10g堿溶蛋白，加入10倍體積溶液A（15.6mmol/L Na2HPO4，3.5mmol/L KH2PO4，pH 7.5），用高速分散機(jī)在10000r/m in下均質(zhì)1min，均質(zhì)液在冷凍離心機(jī)中離心（-20℃，10000×g，20m in），此提取過(guò)程重復(fù)操作二次，沉淀部分即為肌原纖維蛋白。上清液部分：加入50%TCA使上清液最終TCA濃度達(dá)到10%，在離心機(jī)中離心（-20℃，10000× g，20min），上清液部分為非蛋白氮，沉淀部分為肌漿蛋白。蛋白質(zhì)氮和非蛋白質(zhì)氮含量測(cè)定均采用凱氏定氮法。

堿不溶蛋中膠原蛋白測(cè)定（以羥脯氨酸計(jì)）：按照ISO3496：1978（E）《Meat and meat products：Determ ination of L（-）-hydroxyproline content》方法，測(cè)定羥脯氨酸。

1.3.3 蛋白提取率、沉淀率、回收率的測(cè)定 蛋白的提取率、沉淀率、回收率的計(jì)算公式分別為：

蛋白質(zhì)提取率（%）=A/C×100

蛋白質(zhì)沉淀率（%）=（A-B）/A×100

蛋白質(zhì)回收率（%）=（A-B）/C×100

式中：A為第一次離心中層清液中蛋白質(zhì)的含量（mg）；B為第二次離心上清液中蛋白質(zhì)的含量（mg）；C為原料中堿溶蛋白質(zhì)的含量（mg）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次平行測(cè)定值的平均值。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17（Statistical Product and Service Solutions）軟件；數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料的組成

目前，制備魚(yú)糜的鰱魚(yú)采肉前一般要去除魚(yú)鱗、內(nèi)臟和魚(yú)頭。這種預(yù)處理后鰱魚(yú)產(chǎn)生的采肉下腳料構(gòu)成如表1所示。

表1 鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料的構(gòu)成Table 1 The composition ofwaste of silver carp after surimi processing

從表1可以看出，鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料中的殘肉約占下腳料總量56%左右，應(yīng)該是較好的蛋白制備原料，但這部分殘肉實(shí)際上是與其他成分混在一起的，實(shí)際操作難以用簡(jiǎn)單物理方法分離。

鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料的化學(xué)組成如表2所示，可見(jiàn)，其中非水部分主要是蛋白質(zhì)，含量約為16%，占固形物總量的76%，是比較理想的蛋白制備原料。

表2 鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料的化學(xué)組成Table 2 The proximate composition ofwaste of silver carp after surimi processing

鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料中蛋白質(zhì)組分組成的測(cè)定的結(jié)果如表3所示，其中約60%的為堿溶蛋白，約40%為堿不溶蛋白。堿溶蛋白中主要蛋白成分為肌原纖維蛋白具有良好的凝膠性能及其他功能性，并且具有較好的萃取性，適合采用酸堿法（pH-shifting）制備，為本研究的目標(biāo)蛋白；堿不溶蛋白的主要成分為膠原蛋白，是制取明膠的好原料，但是該部分蛋白在較弱的酸堿條件下具有非萃性，酸堿法（pH-shifting）對(duì)該部分蛋白提取率不高，該部分蛋白主要存在于本研究第一次離心后的沉淀中。

2.2 提取工藝條件的確定

2.2.1 pH對(duì)蛋白提取率的影響 pH對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料中堿溶蛋白的提取率的影響如圖1所示，由圖1可以看出堿溶蛋白在pH 5～6范圍內(nèi)提取率最小，偏酸或偏堿條件下蛋白質(zhì)提取率都增加，但偏堿一側(cè)蛋白質(zhì)提取率增加更明顯，pH=12時(shí)堿溶蛋白的提取率達(dá)到89%左右。由圖1可以推斷該蛋白體系的等電點(diǎn)在pH 5～6之間。選取pH=12進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 pH對(duì)蛋白提取率的影響Fig.1 Effectof pH on the extraction rate of protein

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響 pH=12時(shí)，時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響如圖2所示。提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率影響比較顯著，并且提取時(shí)間從5～15m in時(shí)，提取率會(huì)有大約15%增加，15m in后，提取率穩(wěn)定在90%左右。蛋白較短的提取時(shí)間是工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)重要的具有吸引力的條件。提取時(shí)間取15m in。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2 Effectof time on the extraction rate of protein

圖3 提取溫度對(duì)蛋白提取的影響Fig.3 Effectof temperature on the extraction of protein

表3 鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料中蛋白的組分組成Table 3 The Component composition of ptotein ofwaste of silver carp after surimiprocessing

2.2.3 提取溫度對(duì)蛋白提取的影響 固定料液比1∶9、提取時(shí)間15m in、pH=12，溫度對(duì)蛋白提取的影響如圖3所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出從5～30℃，總氮的提取率從88.55%上升到93.32%，但是隨著溫度的升高，蛋白的水解程度也顯著增加，TCA處理后上清中非蛋白氮的提取率從5.12%升高到14.82%，蛋白質(zhì)氮的提取率反而從83.82%降到78.5%，最佳的提取溫度在5℃左右，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)條件可以適當(dāng)?shù)奶岣咛崛囟龋遣灰顺^(guò)15℃。低溫蛋白的水解程度小，更有利于保持蛋白的活性。提取溫度選5℃。

2.2.4 提取料液比對(duì)蛋白提取率的影響 溫度5℃，pH=12條件下，采用兩種方式提取回收蛋白，一段式提取時(shí)間為15m in，兩段式每次提取時(shí)間為7.5m in。如圖4所示，一段式隨著固液比的增加提取率約從74%增加到92%，并且當(dāng)固液比大于1∶12時(shí)提取率趨于穩(wěn)定；如圖5所示，二段式隨著料液比的增加提取率約從78%增加到92%，并且在料液比大于1∶6時(shí)提取率趨于穩(wěn)定。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出兩段式可以節(jié)約水的用量，因此采用兩段式進(jìn)行提取，料液比選用1∶6（3+3）。

圖4 提取料液比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4 Effectof solid-liquid ratio on the extraction of protein

圖5 提取料液比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.5 Effectof solid-liquid ratio on the extraction of protein

2.3 蛋白質(zhì)沉淀pH的確定

利用等電點(diǎn)沉淀技術(shù)，調(diào)節(jié)最適提取條件下的蛋白離心上清液的pH，當(dāng)pH達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)便沉淀出來(lái)。當(dāng)沉淀物中蛋白質(zhì)含量最高或上清液中蛋白質(zhì)含量最低時(shí)，此時(shí)的pH便為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀的最適pH。

如圖6所示，在pH=5.5時(shí)取得最高的蛋白沉淀率，這也是蛋白最低提取率時(shí)的pH。提取液中蛋白在等電點(diǎn)的沉淀率約為90%，這表明大部分先前提取液中的蛋白質(zhì)可以有效的沉淀。

2.4 不同儲(chǔ)藏條件對(duì)堿溶蛋白制備的影響

在5℃條件下，采用兩段式提取，料液比為1∶6（3+3），每段提取時(shí)間為7.5m in，選取pH=12，不同儲(chǔ)藏條件的原料堿溶蛋白制備的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明原料的儲(chǔ)藏對(duì)酸堿法制備堿溶蛋白無(wú)顯著影響。

圖6 pH對(duì)上清液中蛋白沉淀率的影響Fig.6 Effectof pH on the Sedimentation rate of protein

表4 不同儲(chǔ)藏條件的原料制備堿溶蛋白的結(jié)果Table 4 The effects ofmaterials at different storage conditions on the preparing of alkali-soluble protein

3 結(jié)論

酸堿法（pH-shifting）制備鰱魚(yú)魚(yú)糜采肉下腳料堿溶蛋白的最佳工藝的條件為：提取pH為12.0，提取時(shí)間為15min，提取溫度為5℃，采用兩段式提取、提取料液比為1∶6（3+3），最佳沉淀?xiàng)l件為pH 5.5。原料的不同處理對(duì)堿溶蛋白的制備無(wú)顯著影響，在此條件下，堿溶蛋白回收率約為82%。本研究為淡水魚(yú)糜加工下腳料的利用提供了技術(shù)參考，為提高淡水魚(yú)糜加工副產(chǎn)品的附加值提供了技術(shù)支持。

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Study on the preparation of alkali-soluble protein using waste of silver carp after surim iprocessing

CHEN Er-sheng，XU Xue-qin*，XU Yan-shun，JIANG Qi-xing
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The alkali-solub le p rotein was p repared by pH-shifting method using waste of silver carp after surim i p rocessing as raw material.The effect of storage of raw material，extrac ting pH，time，and temperature，ratio of material and buffer，and pH for p recipitate on p reparation of alkali-solub le p rotein was also investigated. Results showed that the op timal parameters for p reparation were extrac ting at pH12.0，for 15m in，at 5℃，using two-stage extraction，at ratio of 1∶6（3+3），at pH5.5 for p recip itate.The recovery of alkali-solub le p rotein was about82%under this condition.Different treatmenthad little difference on the yield of alkali-solub le p rotein.

waste of silver carp after surim ip rocessing；pH-shifting；alkali-solub le p rotein

TS254.9

B

1002-0306（2014）18-0264-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.050

2014－01－16 *通訊聯(lián)系人

陳二生（1987-），男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工。

國(guó)家大宗淡水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-46-22）。