郭峰君，胡 靖，趙 雪

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

海帶巖藻聚糖硫酸酯降解及基本結(jié)構(gòu)分析

郭峰君，胡 靖，趙 雪*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

用離子交換色譜法對海帶巖藻聚糖硫酸酯粗糖進行分離純化，然后采用銅-過氧化氫氧化降解法獲得低分子量多糖，對降解條件和產(chǎn)物進行研究。得出結(jié)論：離子交換色譜中加入一定濃度氯化鈉，可以獲得高硫酸根和巖藻糖含量的巖藻聚糖硫酸酯。紅外光譜和核磁共振分析確定硫酸根的位置在C2或C3上，糖構(gòu)型屬于α-D-吡喃糖。研究表明自由基氧化降解海帶巖藻聚糖硫酸酯的降解條件與其硫酸根和巖藻糖含量有關(guān)，硫酸根含量越高，多糖越難以降解。最優(yōu)降解條件：60℃下，500μL 20mg/mL糖溶液，加入0.0267mol/L乙酸銅，F(xiàn)3、F4加10μL 15%H2O2，F(xiàn)5加50μL 15%H2O2，反應(yīng)4h。采用PAGE凝膠電泳方法可以很好的分析氧化降解產(chǎn)物的分子量分布。

海帶，巖藻聚糖硫酸酯，氧化降解，聚丙烯酰胺凝膠電泳

巖藻聚糖硫酸酯是褐藻、海參和海膽中特有的一種巖藻糖為主的硫酸酯多糖[1]。海參和海膽的巖藻聚糖硫酸酯主要是直鏈的巖藻多糖，沒有支鏈，而且?guī)r藻糖的含量占到總糖含量的90%以上。但是褐藻中的巖藻聚糖硫酸酯的糖組成復(fù)雜，相對分子質(zhì)量從幾萬到幾十萬都有，除了巖藻糖，還含有半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸，其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)隨海藻的種類、生長季節(jié)和提取方法的不同而不同[2]。隨著活性研究的深入，發(fā)現(xiàn)多糖的高級結(jié)構(gòu)、側(cè)鏈的位置以及分支的密度、單糖糖苷鍵的結(jié)合形式、分子量、聚合度以及硫酸根的位置和含量對活性的影響較大[3]。Alban發(fā)現(xiàn)高分子量硫酸多糖很難被吸收，而低分子量多糖溶解性好、黏度小、吸收利用率高，能顯著提高多糖的生物活性[4]。海帶硫酸多糖降解發(fā)法主要有酸降解、堿降解、酶降解以及自由基降解方法[5]。張全斌和Alain Nardella對自由基降解產(chǎn)物分析，得到的低分子多糖活性也較高[6]。本實驗室前期采用H2O2-Cu2+自由基降解法，連同分步超濾，制備了低分子量巖藻聚糖硫酸酯，具有很好的抗血栓、抗病毒、提高免疫力、抗氧化和保護腸胃的功能[7-10]。但是對自由基氧化降解巖藻聚糖硫酸酯的降解條件和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析還需進一步的研究。本文對不同結(jié)構(gòu)的巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)和降解活性進行研究，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析降解產(chǎn)物的分子量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶巖藻聚糖硫酸酯粗糖 日照潔晶海洋生物技術(shù)有限公司；Q-Sepharose FF樹脂 美國Amersham Parmacia Biotech公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（180u、2.5、4.6、7.1、10ku）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、乳糖、葡萄糖醛酸、乙酰氨基葡萄糖） 美國Sigma公司；中空纖維膜（6ku） 天津膜天膜科技有限公司。

DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳儀 北京六一儀器廠；Aglient1100高效液相色譜儀 美國Aglient科技有限公司；ICS2000離子色譜儀 美國DIONEX公司；Nicolet-Nexus 470紅外光譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 陰離子交換色譜法分離純化巖藻聚糖硫酸酯

取巖藻聚糖硫酸酯粗糖300mg溶解于PBS緩沖液（0.05mol/L，pH7.8），然后加入到Q-Sepharose FF強陰離子交換色譜柱（300m L，2.6×30cm）。待多糖吸附后，依次用0、0.5、1.0、1.5、2、2.5mol/L NaCl（PBS緩沖液溶解）梯度洗脫，用硫酸－苯酚法檢測洗脫液的糖含量，分別收集各組分，用截留分子量為10～12ku的透析袋透析脫鹽，用AgNO3檢驗脫鹽完畢后，旋蒸濃縮，凍干后獲得樣品，分別命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6。分別稱量獲得的F1～F6的樣品質(zhì)量，其與300mg的比值即為得率。

1.2.2 海帶巖藻聚糖硫酸酯化學(xué)組成分析 總糖含量采用苯酚硫酸法測定[11]。

1.2.2.1 硫酸根含量測定 采用離子色譜法[12]。選用Dionex離子色譜儀，Ionpac AS11-HC（4×250mm）為分離柱，Dionex Ionpac AG11-HC（4×50mm）為保護柱，ASRSULTRAⅡ為抑制器，抑制電流為238mA，進樣體積為25μL，30mmol/L KOH為淋洗液，控制流速為1.0m L/min。

1.2.2.2 分子量測定 采用高效液相色譜法[13]。采用Agilent 1100高效液相色譜儀，選用TSK-gel G2500 PWxl色譜柱（Tosoh Bioscience），用0.2mol/L的NaCl作為流動相，洗脫速度為0.5m L/m in，保持柱溫40℃，采用示差檢測器（G1362A），以Mw為180u、2.5、4.6、7.1、10ku右旋糖酐為標(biāo)準(zhǔn)品，做多糖分子量對數(shù)與保留時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到分子量計算公式：lgMw=-0.2646tR+ 7.0746（r=0.986，tR為保留時間）。并根據(jù)GPC軟件得到待測多糖的重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）和分配系數(shù)D=Mw/Mn。

1.2.2.3 單糖組成測定 采用柱前衍生高效液相色譜法[14-15]。使用Agilent1100高效液相色譜儀，ZORBAX Eclipse色譜柱XDB-C18分離柱（4.6×250mm，5μm），245nm紫外檢測器（DAD），控制流速為1.0m L/min，保持柱溫為25℃，采用流動相A：10%（V/V）乙腈，0.1mol/L乙酸銨-乙酸緩沖液（pH 5.5）和流動相B：25%（V/V）乙腈，0.1mol/L乙酸銨-乙酸緩沖液（pH 5.5），時間梯度：0→40m in，濃度梯度：流動相B 40%→100%。

1.2.2.4 紅外光譜分析[16]將干燥的各待測樣品與KBr壓制成片，使用Nicolet-Nexus 470傅立葉變換紅外光譜儀，掃描600～4000cm-1波長范圍內(nèi)的光譜吸收值。

1.2.2.5 核磁共振波譜法[17]取多糖樣品F3、F4和F5各100mg分別裝入核磁管中，用0.5m L重水溶解，然后凍干，再用重水溶液溶解后進行檢測，以HDO峰為內(nèi)標(biāo)進行光譜分析。

1.2.3 丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）分析多糖的分子量 100mmol硼酸，100mmol Tris和1mmol EDTA，用水溶解定容至1L，調(diào)pH為8.3，配制成外室緩沖液。1.24mol甘氨酸、200mmol Tris，用水溶解定容至1L，調(diào)pH為8.3，配制成內(nèi)室緩沖液。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和蔗糖用外室緩沖液配成15%分離膠和5%濃縮膠，脫氣備用。制膠時，15%分離膠：分離膠5m L，APS 15μL，TEMED 5μL；5%濃縮膠：濃縮膠1m L，APS 45μL，TEMED 1.5μL。電泳分析時電壓200V，時間30～50m in。然后將分離膠用0.5%阿利新藍(lán)染色30m in后，用0.2%乙酸脫色。硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品凝膠采用UNSCANIT軟件（Silk科技公司，美國）掃描，根據(jù)硫酸軟骨素的分子量和電泳距離，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 低分子量巖藻聚糖硫酸酯制備

1.3.1 自由基降解[18]取4.5g巖藻聚糖硫酸酯粗糖溶于67.5m L蒸餾水，加入0.0267mol/L醋酸銅，用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.5左右，在60℃恒溫加熱。然后用蠕動泵以0.9m L/m in速度加入4.5%H2O2溶液，反應(yīng)中不斷加入2mol/L NaOH保持反應(yīng)液pH為7.5，5h后停止加H2O2。將反應(yīng)液中加入0.3m L 2mol/L NaOH，冷卻至室溫，采用10000r/min離心20min，除去大部分Cu2+，將液體pH調(diào)至中性，加入Chelex 100螯合柱除去殘留的Cu2+。降解產(chǎn)物采用截流分子量為6ku的中空纖維膜超濾，分別收集分子量小于6ku組分和分子量大于6ku組分。分子量小于6ku組分采用截流分子量為500u的透析袋透析脫鹽，然后旋蒸后凍干。

1.3.2 微量降解條件 分別取500μL 20mg/m L F3、F4和F5，加入0.0267mol/L醋酸銅，采用60℃恒溫加熱。F3和F4中加10μL/h的15%H2O2，F(xiàn)4中加50μL/h的15% H2O2。反應(yīng)4h，并隨時用0.3mol/L的NaOH調(diào)至堿性。

2 結(jié)果與討論

2.1 巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)成分分析

采用苯酚硫酸法確定粗糖的總糖含量為66.59%，為了進一步分離純化巖藻聚糖硫酸酯，我們采用陰離子交換色譜對粗糖進行分級純化。采用不同濃度的氯化鈉溶液對多糖進行分離，得到6個不同的組分。表1為分離純化的巖藻聚糖硫酸酯各組分的硫酸根含量的比較。比較看出洗脫用的NaCl的濃度越高，巖藻聚糖硫酸酯的硫酸根含量越高。由于QFF凝膠為強陰離子柱，巖藻聚糖硫酸酯的硫酸根含量越高，與柱子的親和力越強，需用越高濃度的NaCl溶液才能被洗脫下來。其中F1和F2組分硫酸根很低，F(xiàn)5和F6硫酸根最高，超過35%。而F1～F6的得率分別是26.77%、12.85%、33.37%、20.11%、1.9%、0.5%。組分F6雖然硫酸根和巖藻糖含量（見表2）很高，但是因為得率太低，所以后續(xù)實驗沒有以F6為研究對象再進行分析。

表1 巖藻聚糖硫酸酯各組分硫酸根含量的比較Table 1 Comparison of sulfated ester contentof different fucoidan fractions

圖1為F4的HPLC分析結(jié)果。根據(jù)出峰時間來確定樣品中單糖的種類，根據(jù)濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中各單糖的含量。表2為不同巖藻聚糖硫酸酯組分的單糖組成比較。比較發(fā)現(xiàn)，組分的硫酸根含量越高，其巖藻糖含量越高，其中F3、F4和F5巖藻糖含量較高，達到50%，其次是甘露糖和半乳糖含量較高。而低硫組分F1和F2中巖藻糖含量只有30%和21%，但其含有較高的葡萄糖醛酸和半乳糖。

根據(jù)圖2軟骨素分子量標(biāo)準(zhǔn)品得出分子量與移動距離之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），硫酸軟骨素的分子量為2～8ku之間，分子量與電泳距離呈線性關(guān)系。而分子量大于8ku的多糖的分子量與電泳距離沒有呈線性關(guān)系。根據(jù)硫酸軟骨素的分子量為14ku左右，只能大約的估計圖7、圖8中a處硫酸多糖分子量約為20～ 100ku，b處約為8～20ku。

離子交換柱分離純化的多糖組分經(jīng)過截流分子量為10ku的透析袋透析后，采用15%PAGE凝膠電泳分析其分子量分布情況，如圖4所示。比較發(fā)現(xiàn)，采用0和0.5mol/L NaCl洗脫的組分中，分子量低于10ku寡糖含量比較高，而高分子量組分含量很低，說明低濃度氯化鈉可以去除到粗糖中的低硫雜質(zhì)；而1、1.5、2mol/L NaCl洗脫出的組分中高分子量組分含量非常高，但是仍然含有少量的分子量低于10ku的組分，說明透析并不能完全將分子量低于10ku的低分子量糖完全去除掉。

圖2 硫酸軟骨素和硫酸軟骨素酶解物的PAGE電泳分析Fig.2 PAGE electrophoresis analysis of Chondroitin sulfate and its enzymatic hydrolysate

圖3 PAGE凝膠電泳分析硫酸軟骨素分子量-電泳距離之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of the relationship of themolecular weightof chondroitin sulfate and electrophoresis distance by PAGE electrophoresis analysis

圖4 巖藻聚糖硫酸酯粗糖及各洗脫組分的PAGE電泳圖譜Fig.4 PAGE electrophoresis of polysaccharides and elution composition

表2 巖藻聚糖硫酸酯各組分的單糖組成分析Table 2 Comparison ofmolar proportion ofmonosacchride composion in different fucoidan fractions

2.2 巖藻聚糖硫酸酯的紅外分析

圖5 巖藻聚糖硫酸酯粗糖F3、F4和F5紅外圖譜Fig.5 IR spectra of fractions F3，F(xiàn)4 and F5

由圖5可知，F(xiàn)5糖在3444cm-1處為O-H強伸縮振動峰；所有多糖在3000～2800cm處均出現(xiàn)不同程度的吸收，尤其集中在2990cm和2940cm附近，2937cm-1處為C-H伸縮振動峰，這是巖藻糖的甲基吸收峰，是個弱吸收峰；1647cm-1處出現(xiàn)強吸收峰，為N-H變角震動，1417cm-1處是C-O的伸縮振動峰，是個弱吸收峰，說明有少量的糖醛酸存在；1259cm-1處是S=O官能團的伸縮振動峰，是強吸收峰，818cm-1處是C-O-S赤道配位的伸縮振動，表明該糖存在硫酸基團，與硫酸根含量測定結(jié)果相符，屬于α-D-半乳吡喃糖。C-O-S伸縮振動峰的位置與多糖鏈上硫酸根的位置有關(guān)，是連接在巖藻糖C4位上的直立鍵硫酸根，在851cm-1處產(chǎn)生吸收峰，為α-端基差相異構(gòu)的C-H變焦振動，而吸收峰在820cm-1左右的，是連接在巖藻糖C2或C3位，平伏鍵上的硫酸根，由紅外光譜圖得出，該糖的硫酸根連接在C2或C3上。

2.3 巖藻聚糖硫酸酯的核磁共振分析

圖6 低分子量多糖的核磁結(jié)構(gòu)Fig.6 The nuclearmagnetic structure of low molecular weight polysaccharides

圖6為經(jīng)過自由基氧化降解后得到的低分子量多糖的1H NMR譜圖。對于糖來說，1H NMR譜中C-1上的質(zhì)子（H-1）信號通常在4.8～5.5ppm。而C-2和C-6的質(zhì)子信號都集中在3.2～4.8ppm。1.1～1.3ppm為巖藻糖的甲基氫。譜圖中大部分質(zhì)子信號在3.6～5.2ppm，出現(xiàn)在5.1～5.4ppm左右的異頭氫質(zhì)子H-1的信號峰，能初步推斷該糖是α型吡喃糖，與紅外數(shù)據(jù)相吻合。

2.4 不同結(jié)構(gòu)巖藻聚糖硫酸酯降解條件的研究

圖7 F3、F4和F5降解產(chǎn)物的PAGE電泳比較Fig.7 The PAGE electrophoresis analysis of F3、F4、F5

圖7為粗糖及其自由基降解產(chǎn)物的PAGE凝膠電泳分析?？梢钥闯?，采用離子交換色譜分離純化粗糖后，巖藻聚糖硫酸酯的分子量大多為20ku以上，但是仍有少量分子量小于20ku的低分子量多糖和寡糖存在。高分子量巖藻聚糖硫酸酯采用自由基氧化降解后，用截流分子量為6ku的中空纖維素膜過濾，得到分子量小于6ku和分子量大于6ku的兩個部分。由PAGE凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，超濾后得到的分子量小于6ku的巖藻聚硫酸酯的主要是分子量低于2ku的寡糖，而分子量大于6ku的組分中仍然含有分子量小于6ku的低分子量糖和寡糖，說明用超濾膜的截流分子量確定硫酸多糖的分子量存在不準(zhǔn)確性。分析原因認(rèn)為，纖維素膜的截流分子量是根據(jù)球形的蛋白質(zhì)的分子量來確定的，而巖藻聚糖硫酸酯為直鏈多糖，并且具有較高的硫酸根，與中空纖維膜有一定的吸附。因此采用截流分子量為6ku的纖維素膜來分離巖藻聚糖硫酸酯時，只有聚合度小于10的寡糖（分子量大約2ku）通過了纖維素膜，而其他分子量較高的組分無法通過纖維素膜。

采用銅-過氧化氫誘導(dǎo)產(chǎn)生的羥基自由基對巖藻聚糖硫酸酯進行降解，對其降解條件及其產(chǎn)物的分子量之間的關(guān)系進行研究。500μL糖溶液中加入0.0267mol/L銅離子作為催化劑，以10μL/L 15%H2O2進行降解。比較發(fā)現(xiàn)，低硫組分F3、F4比高硫組分F5更容易降解，添加10μL 15%過氧化氫連續(xù)降解4h，低硫組分很快被降解成分子量低于8ku的低分子組分，而高硫組分仍有大量大分子組分沒有降解。因此要降解高硫的F5組分，需要將過氧化氫用量升高到50μL。從圖8可以看出，三個組分都被降解成為低分子組分，產(chǎn)物主要是寡糖和分子量低于8ku的低分子量組分，分子量分布比較廣。說明自由基氧化降解得到的低分子量巖藻聚糖硫酸酯是分子量分布比較廣的多糖的混合物。

圖8 經(jīng)自由基氧化降解和超濾分離后的巖藻聚糖硫酸酯的PAGE電泳分析Fig.8 The PAGE electrophoresis of lowmolecularweight fucoidan after degradation and ultrafiltration

3 結(jié)論

海帶中巖藻聚糖硫酸酯分子量大，糖組成復(fù)雜，分子量分布較廣。采用離子交換色譜可以對巖藻聚糖硫酸酯分離純化，提高巖藻聚糖硫酸酯的純度。采用自由基氧化降解法降解巖藻聚糖硫酸酯，通過調(diào)整過氧化氫濃度來優(yōu)化巖藻聚糖硫酸酯的降解條件。比較發(fā)現(xiàn)硫酸根越高，巖藻聚糖硫酸酯難以降解。采用離子交換PAGE凝膠電泳，可以很好的分析高分子量和低分子量的巖藻聚糖硫酸酯的分子量分布，硫酸多糖的分子量在2～8ku之間，其分子量與電泳距離呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。PAGE電泳法簡單便宜、能夠準(zhǔn)確直觀地表征多糖分子量的分布。實驗發(fā)現(xiàn)，采用截流分子量為6ku的纖維素膜對低分子量巖藻聚糖硫酸酯進行超濾分離，通過纖維素膜的巖藻聚糖硫酸酯分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于6ku，只有分子量大約2ku的組分能夠通過纖維素膜。說明采用球型蛋白定義的超濾膜的截留分子量，并不適用于線性的硫酸多糖。

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Degradation and structure analysis of fucoidan extracted from Lam inaria Japonica

GUO Feng-jun，HU Jing，ZHAO Xue*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

To separate and purify fucoidan from Lam inaria Japonica by anion-exchange chromatography.To obtain and analyze low molecular weight fucoidan by copper-hyd rogen peroxide free rad ical deg radation，High sulfate and fucose content fucoidan were obtained by certain concentration of sod ium chloride from anionexchange column.Infrared spectrum method determ ined the position of the sulfated group was on C2 or C3. NMR further demonstrated the existence ofα-D-pyranose.The molecular weight of fucoidan and low molecular weight fucoidan fractions were analyzed w ith PAGE electrophoresis.Result revealed that the content of sulfate g roup and fucose p layed an im portant role on the free radical deg radation of fucoidan.The fucoidan fraction w ith high sulfate and fucose content was more d ifficult to be degraded.The op timal deg radation cond itions were ob tained：500μL 20mg/m L fucoidan solution，w ith 0.0267mol/L cup ric acetate，10μL 15%H2O2for F3，F(xiàn)4 and 50μL 15%H2O2for F6，reacted for 4h at 60℃.Using the method of PAGE could analyze the distribution of the molecular weight of oxidative degradation p roducts.

Lam inaria Japonica；fucoidan；free rad ical deg radation；electrophoresis

TS254.9

A

1002-0306（2014）18-0093-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.011

2013－12－09 *通訊聯(lián)系人

郭峰君（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：海帶巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)和預(yù)防治療腦血栓活性研究。

國家自然科學(xué)基金（31371759）。