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        表面等離子體共振生物傳感器的構(gòu)建及對(duì)檸檬黃的檢測(cè)

        2014-02-27 21:27:43徐坤等
        分析化學(xué) 2014年1期
        關(guān)鍵詞:檸檬黃飲料

        徐坤等

        摘要:建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器(FTsurface plasmon resonance,F(xiàn)TSPR)檢測(cè)食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結(jié)合的原理,將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結(jié)合到傳感器芯片上,通過(guò)溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃。建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得檢出限13 μg/L;研究了pH值對(duì)檢測(cè)的影響,得到pH 7.4為適宜的體系酸度;回收實(shí)驗(yàn)、實(shí)際樣品檢測(cè)及干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明, 本方法對(duì)檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測(cè)方法相比較,F(xiàn)TSPR傳感器檢測(cè)檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢(shì)。

        關(guān)鍵詞:表面等離子體共振傳感器; 檸檬黃; 小鼠單克隆抗體; 飲料

        1引言

        食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷,不易褪色,且價(jià)格較低而應(yīng)用更廣泛。但是, 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)的化合物,使其安全性降低,使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說(shuō)明迫切需要建立靈敏的檢測(cè)方法和手段。

        檸檬黃是水溶性偶氮類(lèi)合成色素,是被準(zhǔn)許使用的最廣泛的色素之一[1],但是因其安全性, 使用量也受到了諸多限制。2007年英國(guó)南安普敦大學(xué)發(fā)表了一份關(guān)于食用人工色素對(duì)兒童發(fā)育影響的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內(nèi)的7種人工色素可能會(huì)使兒童智商下降5分。隨后, 科學(xué)家們又對(duì)檸檬黃的危害進(jìn)行進(jìn)一步的研究,Kamel[2]和Soltan[3]分別對(duì)雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃, 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動(dòng)癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關(guān)系,并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加,有一定的致突變性[4]。針對(duì)檸檬黃過(guò)量使用的危害,已經(jīng)建立的檢測(cè)方法有紫外可見(jiàn)光分光光度法[5,6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學(xué)法[10]等。這些方法雖得到了很好的應(yīng)用效果,但存在著操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點(diǎn)。表面等離子體共振傳感器(SPR)作為一種選擇性好,靈敏度高,免標(biāo)記,能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)、快速、在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[11],在食品安全方面得到了廣泛的應(yīng)用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測(cè)了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測(cè)了食物中的霉菌毒素,同時(shí)利用金納米擴(kuò)大信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)采用SPR生物傳感器, 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測(cè)了實(shí)際樣品中的檸檬黃,并與紫外檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果表明, SPR檢測(cè)對(duì)檸檬黃有較高的選擇性,并且檢出限(ng級(jí))較低。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        UV2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);FTSPR表面等離子體共振儀(美國(guó)Thermo公司); RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);TGL20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司),透析袋(27 mm,USA)。

        檸檬黃(Tartrazine,TE,95%),牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA,AR),巰基丙酸(Thiohydracrylic acid, MPA, AR),碳酰二亞胺鹽酸鹽(1Ethyl(3dimethyl aminopropyl)carbodiimide,EDC,98%),N羥基琥珀酰亞胺(NHydroxysuccinimide,NHS,AR),日落黃(>87%),胭脂紅(AR),蘇丹紅I(AR),以上試劑均為上海晶純?cè)噭┯邢薰旧a(chǎn);小鼠檸檬黃單克隆抗體(北京瀚海生物試劑有限公司), N,N二甲基甲酰胺(AR,天津市凱力達(dá)化工有限公司),鹽酸乙醇胺(AR,東京化成工業(yè)株式會(huì)社),磷酸鹽緩沖溶液(PBS),橙色飲料1和2購(gòu)于市場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

        2.2實(shí)驗(yàn)方法

        2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測(cè)稱(chēng)取檸檬黃0.05 g,用PBS(0.02 mol/L)配成0.5 g/mL溶液,實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步稀釋。以PBS為參比,1 cm比色皿,在200~600 nm測(cè)定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測(cè)吸光度值,建立吸光度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量橙色飲料1,在0 ℃, 12000 r/min離心30 min, 取上清液稀釋5倍備用。

        2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見(jiàn)分光光度法檢測(cè), 平行測(cè)定3次。根據(jù)文獻(xiàn)[15], 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基,可通過(guò)中間物N羥琥珀酰亞胺(NHS)與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合,形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無(wú)色。將得到的TEBSA產(chǎn)物用紫外可見(jiàn)光分光光度法表征。

        2.2.3SPR傳感器檢測(cè)檸檬黃 (1) 檢測(cè)方法采用溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃:將分析物與對(duì)應(yīng)的抗體混合,并流過(guò)固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變,這樣響應(yīng)信號(hào)與分析物濃度成正比。因?yàn)榭贵w會(huì)帶著結(jié)合上的分析物再次結(jié)合到固定在傳感器表面的分析物上,因此響應(yīng)信號(hào)會(huì)放大。當(dāng)平衡量的分析物和抗體混合時(shí),只有未與分析物結(jié)合的抗體才會(huì)與傳感器表面的分析物結(jié)合,因此響應(yīng)信號(hào)與分析物濃度成反比關(guān)系。首先將MPA鍵合到芯片上,再用EDC/NHS活化羧基,然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上,利用溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃。(2) SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液(30% H2O2濃H2SO4,3∶7, V/V)中清洗2~3 min,取出用大量水沖洗,再用氮?dú)獯蹈?。將干凈的芯片放?0 mmol/L MPA溶液中,在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復(fù)沖洗,再將芯片放入EDC(0.2 mol/L)/NHS(0.05 mol/L)中活化1 h。取出用大量水沖洗,再將芯片轉(zhuǎn)入TEBSA溶液(0.1 g/L,pH=7.4)中浸泡12 h,取出用水沖洗后,用氮?dú)獯蹈蓚溆?。在室溫下,將芯片放入預(yù)先配置好的洗液中浸泡10 min中,將芯片表面的結(jié)合物清除,浸泡過(guò)程中需要振蕩3~5次。取出后用水沖洗,氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

        2.2.4FTSPR傳感器檢測(cè)檸檬黃將處理過(guò)的芯片安裝入儀器,設(shè)定參數(shù),PBS緩沖溶液作為流動(dòng)緩沖液(所有實(shí)驗(yàn)用試液經(jīng)0.45 μm孔徑膜過(guò)濾和超聲脫氣處理),流速固定為1.20 mL/min,采集背景。背景采集完畢后,固定流速為0.2 mL/min,得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過(guò)流動(dòng)泵將系列處理過(guò)的檸檬黃溶液引入流動(dòng)池中,與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸,自由抗體就會(huì)與芯片上的偶聯(lián)物結(jié)合,F(xiàn)TSPR實(shí)時(shí)記錄的波數(shù)變化達(dá)到穩(wěn)定時(shí),再通入PBS至信號(hào)穩(wěn)定。

        2.2.5樣品準(zhǔn)備及檢測(cè)用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液,根據(jù)所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量(一般按抗體與檸檬黃1∶1混合),保證抗體相對(duì)于待測(cè)物是過(guò)量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體,經(jīng)孵育處理后,通入FTSPR傳感器。

        分別取50 mL橙色飲料1和2, 用旋蒸器將水分全部蒸干,用PBS定容至100 mL,備用。稀釋至適宜倍數(shù),進(jìn)行檢測(cè),分別平行測(cè)定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液,用橙色飲料1稀釋后,經(jīng)孵育處理,通入FTSPR傳感器檢測(cè),平行測(cè)定3次。

        3結(jié)果與討論

        3.1紫外光譜檢測(cè)檸檬黃結(jié)果分析

        由圖1可見(jiàn),檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰,在200 nm處有半吸收峰,426 nm為主吸收峰。 通過(guò)線性擬合得線性方程為A=59.3286c (g/L)+0.0421, R2=0.9934。可以作為樣品中檸檬黃檢測(cè)的依據(jù)?;谛旁氡葹?,得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

        利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L, 換算后為0.02 g/kg,低于食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB27602007)[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。

        摘要:建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器(FTsurface plasmon resonance,F(xiàn)TSPR)檢測(cè)食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結(jié)合的原理,將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結(jié)合到傳感器芯片上,通過(guò)溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃。建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得檢出限13 μg/L;研究了pH值對(duì)檢測(cè)的影響,得到pH 7.4為適宜的體系酸度;回收實(shí)驗(yàn)、實(shí)際樣品檢測(cè)及干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明, 本方法對(duì)檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測(cè)方法相比較,F(xiàn)TSPR傳感器檢測(cè)檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢(shì)。

        關(guān)鍵詞:表面等離子體共振傳感器; 檸檬黃; 小鼠單克隆抗體; 飲料

        1引言

        食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷,不易褪色,且價(jià)格較低而應(yīng)用更廣泛。但是, 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)的化合物,使其安全性降低,使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說(shuō)明迫切需要建立靈敏的檢測(cè)方法和手段。

        檸檬黃是水溶性偶氮類(lèi)合成色素,是被準(zhǔn)許使用的最廣泛的色素之一[1],但是因其安全性, 使用量也受到了諸多限制。2007年英國(guó)南安普敦大學(xué)發(fā)表了一份關(guān)于食用人工色素對(duì)兒童發(fā)育影響的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內(nèi)的7種人工色素可能會(huì)使兒童智商下降5分。隨后, 科學(xué)家們又對(duì)檸檬黃的危害進(jìn)行進(jìn)一步的研究,Kamel[2]和Soltan[3]分別對(duì)雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃, 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動(dòng)癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關(guān)系,并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加,有一定的致突變性[4]。針對(duì)檸檬黃過(guò)量使用的危害,已經(jīng)建立的檢測(cè)方法有紫外可見(jiàn)光分光光度法[5,6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學(xué)法[10]等。這些方法雖得到了很好的應(yīng)用效果,但存在著操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點(diǎn)。表面等離子體共振傳感器(SPR)作為一種選擇性好,靈敏度高,免標(biāo)記,能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)、快速、在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[11],在食品安全方面得到了廣泛的應(yīng)用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測(cè)了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測(cè)了食物中的霉菌毒素,同時(shí)利用金納米擴(kuò)大信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)采用SPR生物傳感器, 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測(cè)了實(shí)際樣品中的檸檬黃,并與紫外檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果表明, SPR檢測(cè)對(duì)檸檬黃有較高的選擇性,并且檢出限(ng級(jí))較低。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        UV2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);FTSPR表面等離子體共振儀(美國(guó)Thermo公司); RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);TGL20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司),透析袋(27 mm,USA)。

        檸檬黃(Tartrazine,TE,95%),牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA,AR),巰基丙酸(Thiohydracrylic acid, MPA, AR),碳酰二亞胺鹽酸鹽(1Ethyl(3dimethyl aminopropyl)carbodiimide,EDC,98%),N羥基琥珀酰亞胺(NHydroxysuccinimide,NHS,AR),日落黃(>87%),胭脂紅(AR),蘇丹紅I(AR),以上試劑均為上海晶純?cè)噭┯邢薰旧a(chǎn);小鼠檸檬黃單克隆抗體(北京瀚海生物試劑有限公司), N,N二甲基甲酰胺(AR,天津市凱力達(dá)化工有限公司),鹽酸乙醇胺(AR,東京化成工業(yè)株式會(huì)社),磷酸鹽緩沖溶液(PBS),橙色飲料1和2購(gòu)于市場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

        2.2實(shí)驗(yàn)方法

        2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測(cè)稱(chēng)取檸檬黃0.05 g,用PBS(0.02 mol/L)配成0.5 g/mL溶液,實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步稀釋。以PBS為參比,1 cm比色皿,在200~600 nm測(cè)定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測(cè)吸光度值,建立吸光度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量橙色飲料1,在0 ℃, 12000 r/min離心30 min, 取上清液稀釋5倍備用。

        2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見(jiàn)分光光度法檢測(cè), 平行測(cè)定3次。根據(jù)文獻(xiàn)[15], 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基,可通過(guò)中間物N羥琥珀酰亞胺(NHS)與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合,形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無(wú)色。將得到的TEBSA產(chǎn)物用紫外可見(jiàn)光分光光度法表征。

        2.2.3SPR傳感器檢測(cè)檸檬黃 (1) 檢測(cè)方法采用溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃:將分析物與對(duì)應(yīng)的抗體混合,并流過(guò)固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變,這樣響應(yīng)信號(hào)與分析物濃度成正比。因?yàn)榭贵w會(huì)帶著結(jié)合上的分析物再次結(jié)合到固定在傳感器表面的分析物上,因此響應(yīng)信號(hào)會(huì)放大。當(dāng)平衡量的分析物和抗體混合時(shí),只有未與分析物結(jié)合的抗體才會(huì)與傳感器表面的分析物結(jié)合,因此響應(yīng)信號(hào)與分析物濃度成反比關(guān)系。首先將MPA鍵合到芯片上,再用EDC/NHS活化羧基,然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上,利用溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃。(2) SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液(30% H2O2濃H2SO4,3∶7, V/V)中清洗2~3 min,取出用大量水沖洗,再用氮?dú)獯蹈?。將干凈的芯片放?0 mmol/L MPA溶液中,在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復(fù)沖洗,再將芯片放入EDC(0.2 mol/L)/NHS(0.05 mol/L)中活化1 h。取出用大量水沖洗,再將芯片轉(zhuǎn)入TEBSA溶液(0.1 g/L,pH=7.4)中浸泡12 h,取出用水沖洗后,用氮?dú)獯蹈蓚溆?。在室溫下,將芯片放入預(yù)先配置好的洗液中浸泡10 min中,將芯片表面的結(jié)合物清除,浸泡過(guò)程中需要振蕩3~5次。取出后用水沖洗,氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

        2.2.4FTSPR傳感器檢測(cè)檸檬黃將處理過(guò)的芯片安裝入儀器,設(shè)定參數(shù),PBS緩沖溶液作為流動(dòng)緩沖液(所有實(shí)驗(yàn)用試液經(jīng)0.45 μm孔徑膜過(guò)濾和超聲脫氣處理),流速固定為1.20 mL/min,采集背景。背景采集完畢后,固定流速為0.2 mL/min,得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過(guò)流動(dòng)泵將系列處理過(guò)的檸檬黃溶液引入流動(dòng)池中,與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸,自由抗體就會(huì)與芯片上的偶聯(lián)物結(jié)合,F(xiàn)TSPR實(shí)時(shí)記錄的波數(shù)變化達(dá)到穩(wěn)定時(shí),再通入PBS至信號(hào)穩(wěn)定。

        2.2.5樣品準(zhǔn)備及檢測(cè)用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液,根據(jù)所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量(一般按抗體與檸檬黃1∶1混合),保證抗體相對(duì)于待測(cè)物是過(guò)量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體,經(jīng)孵育處理后,通入FTSPR傳感器。

        分別取50 mL橙色飲料1和2, 用旋蒸器將水分全部蒸干,用PBS定容至100 mL,備用。稀釋至適宜倍數(shù),進(jìn)行檢測(cè),分別平行測(cè)定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液,用橙色飲料1稀釋后,經(jīng)孵育處理,通入FTSPR傳感器檢測(cè),平行測(cè)定3次。

        3結(jié)果與討論

        3.1紫外光譜檢測(cè)檸檬黃結(jié)果分析

        由圖1可見(jiàn),檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰,在200 nm處有半吸收峰,426 nm為主吸收峰。 通過(guò)線性擬合得線性方程為A=59.3286c (g/L)+0.0421, R2=0.9934??梢宰鳛闃悠分袡幟庶S檢測(cè)的依據(jù)?;谛旁氡葹?,得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

        利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L, 換算后為0.02 g/kg,低于食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB27602007)[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。

        摘要:建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器(FTsurface plasmon resonance,F(xiàn)TSPR)檢測(cè)食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結(jié)合的原理,將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結(jié)合到傳感器芯片上,通過(guò)溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃。建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得檢出限13 μg/L;研究了pH值對(duì)檢測(cè)的影響,得到pH 7.4為適宜的體系酸度;回收實(shí)驗(yàn)、實(shí)際樣品檢測(cè)及干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明, 本方法對(duì)檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測(cè)方法相比較,F(xiàn)TSPR傳感器檢測(cè)檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢(shì)。

        關(guān)鍵詞:表面等離子體共振傳感器; 檸檬黃; 小鼠單克隆抗體; 飲料

        1引言

        食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷,不易褪色,且價(jià)格較低而應(yīng)用更廣泛。但是, 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)的化合物,使其安全性降低,使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說(shuō)明迫切需要建立靈敏的檢測(cè)方法和手段。

        檸檬黃是水溶性偶氮類(lèi)合成色素,是被準(zhǔn)許使用的最廣泛的色素之一[1],但是因其安全性, 使用量也受到了諸多限制。2007年英國(guó)南安普敦大學(xué)發(fā)表了一份關(guān)于食用人工色素對(duì)兒童發(fā)育影響的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內(nèi)的7種人工色素可能會(huì)使兒童智商下降5分。隨后, 科學(xué)家們又對(duì)檸檬黃的危害進(jìn)行進(jìn)一步的研究,Kamel[2]和Soltan[3]分別對(duì)雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃, 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動(dòng)癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關(guān)系,并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加,有一定的致突變性[4]。針對(duì)檸檬黃過(guò)量使用的危害,已經(jīng)建立的檢測(cè)方法有紫外可見(jiàn)光分光光度法[5,6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學(xué)法[10]等。這些方法雖得到了很好的應(yīng)用效果,但存在著操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點(diǎn)。表面等離子體共振傳感器(SPR)作為一種選擇性好,靈敏度高,免標(biāo)記,能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)、快速、在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[11],在食品安全方面得到了廣泛的應(yīng)用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測(cè)了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測(cè)了食物中的霉菌毒素,同時(shí)利用金納米擴(kuò)大信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)采用SPR生物傳感器, 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測(cè)了實(shí)際樣品中的檸檬黃,并與紫外檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果表明, SPR檢測(cè)對(duì)檸檬黃有較高的選擇性,并且檢出限(ng級(jí))較低。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        UV2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);FTSPR表面等離子體共振儀(美國(guó)Thermo公司); RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);TGL20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司),透析袋(27 mm,USA)。

        檸檬黃(Tartrazine,TE,95%),牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA,AR),巰基丙酸(Thiohydracrylic acid, MPA, AR),碳酰二亞胺鹽酸鹽(1Ethyl(3dimethyl aminopropyl)carbodiimide,EDC,98%),N羥基琥珀酰亞胺(NHydroxysuccinimide,NHS,AR),日落黃(>87%),胭脂紅(AR),蘇丹紅I(AR),以上試劑均為上海晶純?cè)噭┯邢薰旧a(chǎn);小鼠檸檬黃單克隆抗體(北京瀚海生物試劑有限公司), N,N二甲基甲酰胺(AR,天津市凱力達(dá)化工有限公司),鹽酸乙醇胺(AR,東京化成工業(yè)株式會(huì)社),磷酸鹽緩沖溶液(PBS),橙色飲料1和2購(gòu)于市場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

        2.2實(shí)驗(yàn)方法

        2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測(cè)稱(chēng)取檸檬黃0.05 g,用PBS(0.02 mol/L)配成0.5 g/mL溶液,實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步稀釋。以PBS為參比,1 cm比色皿,在200~600 nm測(cè)定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測(cè)吸光度值,建立吸光度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量橙色飲料1,在0 ℃, 12000 r/min離心30 min, 取上清液稀釋5倍備用。

        2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見(jiàn)分光光度法檢測(cè), 平行測(cè)定3次。根據(jù)文獻(xiàn)[15], 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基,可通過(guò)中間物N羥琥珀酰亞胺(NHS)與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合,形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無(wú)色。將得到的TEBSA產(chǎn)物用紫外可見(jiàn)光分光光度法表征。

        2.2.3SPR傳感器檢測(cè)檸檬黃 (1) 檢測(cè)方法采用溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃:將分析物與對(duì)應(yīng)的抗體混合,并流過(guò)固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變,這樣響應(yīng)信號(hào)與分析物濃度成正比。因?yàn)榭贵w會(huì)帶著結(jié)合上的分析物再次結(jié)合到固定在傳感器表面的分析物上,因此響應(yīng)信號(hào)會(huì)放大。當(dāng)平衡量的分析物和抗體混合時(shí),只有未與分析物結(jié)合的抗體才會(huì)與傳感器表面的分析物結(jié)合,因此響應(yīng)信號(hào)與分析物濃度成反比關(guān)系。首先將MPA鍵合到芯片上,再用EDC/NHS活化羧基,然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上,利用溶液競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檸檬黃。(2) SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液(30% H2O2濃H2SO4,3∶7, V/V)中清洗2~3 min,取出用大量水沖洗,再用氮?dú)獯蹈?。將干凈的芯片放?0 mmol/L MPA溶液中,在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復(fù)沖洗,再將芯片放入EDC(0.2 mol/L)/NHS(0.05 mol/L)中活化1 h。取出用大量水沖洗,再將芯片轉(zhuǎn)入TEBSA溶液(0.1 g/L,pH=7.4)中浸泡12 h,取出用水沖洗后,用氮?dú)獯蹈蓚溆?。在室溫下,將芯片放入預(yù)先配置好的洗液中浸泡10 min中,將芯片表面的結(jié)合物清除,浸泡過(guò)程中需要振蕩3~5次。取出后用水沖洗,氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

        2.2.4FTSPR傳感器檢測(cè)檸檬黃將處理過(guò)的芯片安裝入儀器,設(shè)定參數(shù),PBS緩沖溶液作為流動(dòng)緩沖液(所有實(shí)驗(yàn)用試液經(jīng)0.45 μm孔徑膜過(guò)濾和超聲脫氣處理),流速固定為1.20 mL/min,采集背景。背景采集完畢后,固定流速為0.2 mL/min,得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過(guò)流動(dòng)泵將系列處理過(guò)的檸檬黃溶液引入流動(dòng)池中,與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸,自由抗體就會(huì)與芯片上的偶聯(lián)物結(jié)合,F(xiàn)TSPR實(shí)時(shí)記錄的波數(shù)變化達(dá)到穩(wěn)定時(shí),再通入PBS至信號(hào)穩(wěn)定。

        2.2.5樣品準(zhǔn)備及檢測(cè)用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液,根據(jù)所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量(一般按抗體與檸檬黃1∶1混合),保證抗體相對(duì)于待測(cè)物是過(guò)量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體,經(jīng)孵育處理后,通入FTSPR傳感器。

        分別取50 mL橙色飲料1和2, 用旋蒸器將水分全部蒸干,用PBS定容至100 mL,備用。稀釋至適宜倍數(shù),進(jìn)行檢測(cè),分別平行測(cè)定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液,用橙色飲料1稀釋后,經(jīng)孵育處理,通入FTSPR傳感器檢測(cè),平行測(cè)定3次。

        3結(jié)果與討論

        3.1紫外光譜檢測(cè)檸檬黃結(jié)果分析

        由圖1可見(jiàn),檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰,在200 nm處有半吸收峰,426 nm為主吸收峰。 通過(guò)線性擬合得線性方程為A=59.3286c (g/L)+0.0421, R2=0.9934??梢宰鳛闃悠分袡幟庶S檢測(cè)的依據(jù)?;谛旁氡葹?,得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

        利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L, 換算后為0.02 g/kg,低于食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB27602007)[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。

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