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        液相色譜法測(cè)定抗體與對(duì)硫磷、異丙威及其競(jìng)爭(zhēng)原的吸附常數(shù)

        2014-02-27 21:52:32王鳴華等
        分析化學(xué) 2014年1期
        關(guān)鍵詞:液相色譜抗體

        王鳴華等

        摘要:為建立一種測(cè)定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法,本研究設(shè)計(jì)合成了5種對(duì)硫磷半抗原和2種異丙威半抗原,將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原,免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)的多克隆抗體;采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法,測(cè)定了抗體與對(duì)硫磷、異丙威及其競(jìng)爭(zhēng)原的吸附性能,并通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合抗體與化合物的吸附行為,獲得相應(yīng)的吸附常數(shù)。結(jié)果表明抗體與小分子化合物的吸附動(dòng)力學(xué)符合Freundilich模型,抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為:對(duì)硫磷>P1>P4>P3>P2>P5,大小順序與ELISA親和常數(shù)的測(cè)定結(jié)果相符,與ELISA靈敏度測(cè)定結(jié)果有很好的相關(guān)性。

        關(guān)鍵詞:液相色譜; 對(duì)硫磷; 異丙威; 競(jìng)爭(zhēng)原; 抗體; 吸附常數(shù)

        1引言

        基于抗原抗體分子識(shí)別的免疫分析技術(shù),特別是酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzymelinked Immunosorbent Assay, ELISA)以特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn),在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標(biāo)記物是小分子免疫分析中的4個(gè)基本要素,抗體是核心試劑,而抗體的親和力(Affinity)是確定抗體性質(zhì)的重要參數(shù)之一,是指抗體與抗原結(jié)合的緊密程度,多以親和常數(shù)(Affinity constant)表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù),該法不受抗原分子量大小的限制,操作簡(jiǎn)便易行,結(jié)果可靠。但該方法只能測(cè)定抗體與包被抗原的親和力,而不能測(cè)定抗體與待測(cè)小分子化合物的親和力。

        在競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法中,往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4],即當(dāng)抗體與待測(cè)化合物的親和力不變時(shí),抗體與包被抗原的親和力越弱,待測(cè)化合物的競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng),方法靈敏度就越高。因此,抗體與包被抗原的親和力強(qiáng)弱不能指導(dǎo)方法建立中包被抗原的篩選,只能合成多種包被抗原后,通過(guò)免疫分析結(jié)果的評(píng)價(jià)篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術(shù)對(duì)抗體和半抗原進(jìn)行模擬分析[6],選擇合適的異源半抗原(競(jìng)爭(zhēng)原)。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。因而,建立一種簡(jiǎn)便、可靠的能直接比較抗體與競(jìng)爭(zhēng)原和待測(cè)物親和力強(qiáng)弱的方法,可減少免疫分析中競(jìng)爭(zhēng)原篩選的盲目性和工作量。

        在ELISA測(cè)定中,抗體與競(jìng)爭(zhēng)原的吸附屬于固液吸附,而固體液體界面的吸附過(guò)程可用Langmiur或Freundilich吸附動(dòng)力學(xué)模型描述,獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關(guān)利用吸附常數(shù)描述抗體與競(jìng)爭(zhēng)原或待測(cè)物親和力大小的文章尚未見報(bào)道。本研究以抗對(duì)硫磷和異丙威抗體為例,采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法,測(cè)定“寬譜”抗體對(duì)對(duì)硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力,通過(guò)吸附常數(shù)的比較,判斷抗體的特性及競(jìng)爭(zhēng)原的優(yōu)劣,并與ELISA分析結(jié)果相比較,驗(yàn)證了方法的可行性。2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);iMARKTM酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司);DU 800核酸蛋白儀(美國(guó)Beckman公司);Wellwash Plus洗板機(jī)(美國(guó)Thermo公司);96孔聚乙烯酶標(biāo)板(加拿大Jet Biochemical公司);移液槍(美國(guó)Eppendorf 公司)。

        對(duì)硫磷,異丙威標(biāo)準(zhǔn)品(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心);牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、二抗(羊抗兔)(SIGMA公司);碳酸鹽緩沖液(CBS,0.05 mol/L,pH 9.6),磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1 mol/L,pH 7.4);PBST等緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制);甲醇(色譜純,美國(guó)天地公司);其它試劑均為分析純。

        2.2半抗原合成

        摘要:為建立一種測(cè)定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法,本研究設(shè)計(jì)合成了5種對(duì)硫磷半抗原和2種異丙威半抗原,將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原,免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)的多克隆抗體;采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法,測(cè)定了抗體與對(duì)硫磷、異丙威及其競(jìng)爭(zhēng)原的吸附性能,并通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合抗體與化合物的吸附行為,獲得相應(yīng)的吸附常數(shù)。結(jié)果表明抗體與小分子化合物的吸附動(dòng)力學(xué)符合Freundilich模型,抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為:對(duì)硫磷>P1>P4>P3>P2>P5,大小順序與ELISA親和常數(shù)的測(cè)定結(jié)果相符,與ELISA靈敏度測(cè)定結(jié)果有很好的相關(guān)性。

        關(guān)鍵詞:液相色譜; 對(duì)硫磷; 異丙威; 競(jìng)爭(zhēng)原; 抗體; 吸附常數(shù)

        1引言

        基于抗原抗體分子識(shí)別的免疫分析技術(shù),特別是酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzymelinked Immunosorbent Assay, ELISA)以特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn),在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標(biāo)記物是小分子免疫分析中的4個(gè)基本要素,抗體是核心試劑,而抗體的親和力(Affinity)是確定抗體性質(zhì)的重要參數(shù)之一,是指抗體與抗原結(jié)合的緊密程度,多以親和常數(shù)(Affinity constant)表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù),該法不受抗原分子量大小的限制,操作簡(jiǎn)便易行,結(jié)果可靠。但該方法只能測(cè)定抗體與包被抗原的親和力,而不能測(cè)定抗體與待測(cè)小分子化合物的親和力。

        在競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法中,往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4],即當(dāng)抗體與待測(cè)化合物的親和力不變時(shí),抗體與包被抗原的親和力越弱,待測(cè)化合物的競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng),方法靈敏度就越高。因此,抗體與包被抗原的親和力強(qiáng)弱不能指導(dǎo)方法建立中包被抗原的篩選,只能合成多種包被抗原后,通過(guò)免疫分析結(jié)果的評(píng)價(jià)篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術(shù)對(duì)抗體和半抗原進(jìn)行模擬分析[6],選擇合適的異源半抗原(競(jìng)爭(zhēng)原)。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。因而,建立一種簡(jiǎn)便、可靠的能直接比較抗體與競(jìng)爭(zhēng)原和待測(cè)物親和力強(qiáng)弱的方法,可減少免疫分析中競(jìng)爭(zhēng)原篩選的盲目性和工作量。

        在ELISA測(cè)定中,抗體與競(jìng)爭(zhēng)原的吸附屬于固液吸附,而固體液體界面的吸附過(guò)程可用Langmiur或Freundilich吸附動(dòng)力學(xué)模型描述,獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關(guān)利用吸附常數(shù)描述抗體與競(jìng)爭(zhēng)原或待測(cè)物親和力大小的文章尚未見報(bào)道。本研究以抗對(duì)硫磷和異丙威抗體為例,采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法,測(cè)定“寬譜”抗體對(duì)對(duì)硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力,通過(guò)吸附常數(shù)的比較,判斷抗體的特性及競(jìng)爭(zhēng)原的優(yōu)劣,并與ELISA分析結(jié)果相比較,驗(yàn)證了方法的可行性。2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);iMARKTM酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司);DU 800核酸蛋白儀(美國(guó)Beckman公司);Wellwash Plus洗板機(jī)(美國(guó)Thermo公司);96孔聚乙烯酶標(biāo)板(加拿大Jet Biochemical公司);移液槍(美國(guó)Eppendorf 公司)。

        對(duì)硫磷,異丙威標(biāo)準(zhǔn)品(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心);牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、二抗(羊抗兔)(SIGMA公司);碳酸鹽緩沖液(CBS,0.05 mol/L,pH 9.6),磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1 mol/L,pH 7.4);PBST等緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制);甲醇(色譜純,美國(guó)天地公司);其它試劑均為分析純。

        2.2半抗原合成

        摘要:為建立一種測(cè)定抗體與小分子化合物吸附性能的色譜分析方法,本研究設(shè)計(jì)合成了5種對(duì)硫磷半抗原和2種異丙威半抗原,將半抗原P1和A1與同一載體蛋白偶聯(lián)制備“多簇”免疫抗原,免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)的多克隆抗體;采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法,測(cè)定了抗體與對(duì)硫磷、異丙威及其競(jìng)爭(zhēng)原的吸附性能,并通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合抗體與化合物的吸附行為,獲得相應(yīng)的吸附常數(shù)。結(jié)果表明抗體與小分子化合物的吸附動(dòng)力學(xué)符合Freundilich模型,抗體與不同化合物的吸附常數(shù)為:對(duì)硫磷>P1>P4>P3>P2>P5,大小順序與ELISA親和常數(shù)的測(cè)定結(jié)果相符,與ELISA靈敏度測(cè)定結(jié)果有很好的相關(guān)性。

        關(guān)鍵詞:液相色譜; 對(duì)硫磷; 異丙威; 競(jìng)爭(zhēng)原; 抗體; 吸附常數(shù)

        1引言

        基于抗原抗體分子識(shí)別的免疫分析技術(shù),特別是酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzymelinked Immunosorbent Assay, ELISA)以特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn),在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]。半抗原、人工抗原、抗體及標(biāo)記物是小分子免疫分析中的4個(gè)基本要素,抗體是核心試劑,而抗體的親和力(Affinity)是確定抗體性質(zhì)的重要參數(shù)之一,是指抗體與抗原結(jié)合的緊密程度,多以親和常數(shù)(Affinity constant)表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù),該法不受抗原分子量大小的限制,操作簡(jiǎn)便易行,結(jié)果可靠。但該方法只能測(cè)定抗體與包被抗原的親和力,而不能測(cè)定抗體與待測(cè)小分子化合物的親和力。

        在競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法中,往往異源分析的靈敏度明顯高于同源分析[4],即當(dāng)抗體與待測(cè)化合物的親和力不變時(shí),抗體與包被抗原的親和力越弱,待測(cè)化合物的競(jìng)爭(zhēng)能力越強(qiáng),方法靈敏度就越高。因此,抗體與包被抗原的親和力強(qiáng)弱不能指導(dǎo)方法建立中包被抗原的篩選,只能合成多種包被抗原后,通過(guò)免疫分析結(jié)果的評(píng)價(jià)篩選最佳的包被抗原[5]或利用分子模擬技術(shù)對(duì)抗體和半抗原進(jìn)行模擬分析[6],選擇合適的異源半抗原(競(jìng)爭(zhēng)原)。而這些方法存在一定的盲目性或需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。因而,建立一種簡(jiǎn)便、可靠的能直接比較抗體與競(jìng)爭(zhēng)原和待測(cè)物親和力強(qiáng)弱的方法,可減少免疫分析中競(jìng)爭(zhēng)原篩選的盲目性和工作量。

        在ELISA測(cè)定中,抗體與競(jìng)爭(zhēng)原的吸附屬于固液吸附,而固體液體界面的吸附過(guò)程可用Langmiur或Freundilich吸附動(dòng)力學(xué)模型描述,獲得的吸附常數(shù)可用于表示主體和客體間的親和力大小[7]。有關(guān)利用吸附常數(shù)描述抗體與競(jìng)爭(zhēng)原或待測(cè)物親和力大小的文章尚未見報(bào)道。本研究以抗對(duì)硫磷和異丙威抗體為例,采用高效液相色譜結(jié)合固相吸附的方法,測(cè)定“寬譜”抗體對(duì)對(duì)硫磷、異丙威及其半抗原的吸附能力,通過(guò)吸附常數(shù)的比較,判斷抗體的特性及競(jìng)爭(zhēng)原的優(yōu)劣,并與ELISA分析結(jié)果相比較,驗(yàn)證了方法的可行性。2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);iMARKTM酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司);DU 800核酸蛋白儀(美國(guó)Beckman公司);Wellwash Plus洗板機(jī)(美國(guó)Thermo公司);96孔聚乙烯酶標(biāo)板(加拿大Jet Biochemical公司);移液槍(美國(guó)Eppendorf 公司)。

        對(duì)硫磷,異丙威標(biāo)準(zhǔn)品(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心);牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、二抗(羊抗兔)(SIGMA公司);碳酸鹽緩沖液(CBS,0.05 mol/L,pH 9.6),磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1 mol/L,pH 7.4);PBST等緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制);甲醇(色譜純,美國(guó)天地公司);其它試劑均為分析純。

        2.2半抗原合成

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