宋文婷 朱瑞蘭 余光勤 羅玉蘭 袁澤利

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563003)

0 前言

金屬離子和陰離子是一類重要的環(huán)境污染物，它們對(duì)人體健康存在著巨大的威脅，因而探尋這些物質(zhì)的檢測(cè)方法對(duì)生命、環(huán)境和醫(yī)學(xué)科學(xué)等領(lǐng)域都有著十分重要的意義[1]。例如：銅是生物體中基本的微量元素之一，但在生物體內(nèi)攝入過量的銅也會(huì)產(chǎn)生毒性，從而引起膽汁排泄銅的功能紊亂、慢性活動(dòng)性肝炎、帕金森綜合癥、腎小管中毒等神經(jīng)性疾病[2-3]。而焦硫酸根離子(S2O72-)因其在生物和醫(yī)藥學(xué)方面的重要作用，而已有關(guān)于研究其致人死亡原因的探測(cè)報(bào)道[4]。人體攝取銅(II)和S2O72-的主要途徑是經(jīng)食物、水及環(huán)境，因此檢測(cè)食物或水中Cu2+的新分析方法在醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。目前已經(jīng)發(fā)展有諸如分光光度法、電化學(xué)法、原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法等[5]方法應(yīng)用于Cu2+的檢測(cè)研究，但這些研究方法存在著需要昂貴儀器和復(fù)雜的操作步驟[6-7]。熒光分析法具有靈敏度高、可實(shí)時(shí)檢測(cè)、對(duì)樣品基本無損傷且使用方便等優(yōu)點(diǎn)而正成為當(dāng)前研究重金屬離子探測(cè)的方法之一[8]。當(dāng)前已發(fā)展了一些具有進(jìn)一步開發(fā)前景的Cu2+熒光探針[9-10]，但這些探針往往只能實(shí)現(xiàn)單一的探測(cè)功能，無法實(shí)現(xiàn)多功能或連續(xù)測(cè)試功能。為此，本研究基于以激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)而具有良好的光物理過程[11]的苯并咪唑化合物為母核，通過其與水楊醛一步反應(yīng)簡(jiǎn)單制備得到具有多個(gè)氮氧配位原子的苯并咪唑化合物(圖1)，并通過紫外-可見光譜和熒光光譜研究其對(duì)常見金屬離子和陰離子選擇性識(shí)別性能。研究結(jié)果表明：Cu2+具有對(duì)目標(biāo)探針熒光猝滅作用，而S2O7-具有對(duì)該熒光猝滅體系熒光恢復(fù)作用。據(jù)此，提出了基于苯并咪唑的Cu2+，S2O7-的“關(guān)-開”型雙功能連續(xù)性熒光探針。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 5973氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；Varian 1000 FT-IR紅外光譜(KBr壓片，美國(guó)Varian公司)；MS HP-1100質(zhì)譜儀(德國(guó) HP公司)；奧立龍868酸度計(jì)(美國(guó)奧立龍公司)；TU-1901雙光束紫外-可見分光光計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；VARIAN Cary Eclipse 熒光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)；BrukerAV-400型核磁共振儀(瑞士 Broker公司)。

所用試劑除鄰苯二胺為化學(xué)純外，其余均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 目標(biāo)探針(HL)的合成

分別取胺甲基苯并咪唑和水楊醛各10 mmol溶解于30 mL無水乙醇中，于微波儀下微波反應(yīng)30 min，冷卻過濾，收率為85.6%。MS(ESI)m/z：253[M++2]，理論計(jì)算值為251.1元素分析(理論)，C15H13N3O：C 71.70，H 5.21，N 16.72；檢測(cè) C 71.23，H 5.56，N 16.58；1H NMR(DMSO-d6,ppm)：13.03(s，1H，OH)，11.85(s，1H，NH)，8.95(s，1H，CH=N)，7.43-8.17(m，8H，Ar-H)，3.36(s，2H，CH2)；FT-IR(cm-1)：3489，3414，3305，3143，1615，1590，1544，1406，1241，865，752，634。

圖1 HL的合成路線Figure 1 Synthetic route for HL.

1.3 溶液的配制

受體(L)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的受體溶于二次雙蒸水中，制成濃度為2.0×10-5mol/L的儲(chǔ)備溶液，冷藏保存于冰箱，使用時(shí)根據(jù)需要適當(dāng)稀釋。

常見金屬離子和陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的各金屬鹽和各陰離子鈉鹽或鉀鹽溶于二次雙蒸水中，制成濃度為1.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備溶液，冰箱冷藏保存，使用時(shí)根據(jù)需要適當(dāng)稀釋。

1.4 探針性能測(cè)試

先于10 mL容量瓶中加入5 mL二次雙蒸水，然后用微量進(jìn)樣器加入一定體積的HL標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入一定體積的金屬離子或陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后用二次雙蒸水稀釋定容至10 mL，搖勻并放置一定時(shí)間，測(cè)其紫外-可見光譜和熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)探針的結(jié)構(gòu)表征

在目標(biāo)探針的1H NMR譜中，分別在13.03，11.85 ppm觀察到OH和NH的質(zhì)子化學(xué)位移，在8.95 ppm觀察到CH=N的特征質(zhì)子化學(xué)位移[12]說明目標(biāo)探針的生成。此外，在7.43～8.17 ppm處為芳環(huán)的質(zhì)子化學(xué)位移。在目標(biāo)探針的FT-IR譜中，在1615 cm-1也觀察到C=N特征振動(dòng)吸收峰[13]，進(jìn)一步驗(yàn)證了目標(biāo)探針的生成。結(jié)合元素分析和質(zhì)譜可以確定成功合成得到目標(biāo)探針。

2.2 探針(HL)對(duì)Cu2+識(shí)別研究

2.2.1 紫外光譜考察探針對(duì)常見陰陽離子選擇性

探針HL(20 μmol/L)及其與常見金屬離子、陰離子(20 μmol/L)的紫外-可見吸收光譜示于圖2。由圖2可以看出，探針HL與Cu2+混合后其紫外吸收光譜發(fā)生了顯著變化，其在345 nm處產(chǎn)生了一個(gè)新的吸收峰，探針在280 nm處的吸收強(qiáng)度也發(fā)生了顯著的降低，說明了探針HL與Cu2+結(jié)合發(fā)生了作用。而目標(biāo)探針對(duì)本研究范圍內(nèi)使用的常見陰離子無特異性選擇。

圖2 HL對(duì)常見金屬離子和陰離子的紫外光譜(A：HL與金屬離子;B：HL與陰離子) Figure 2 The UV-vis spectra of HL (A) with metal cations, such as Na+ or K+ salts; and (B) with anions, such as Cl- or NO3-.

2.2.2 熒光光譜考察探針對(duì)常見陰陽離子的選擇性

在同樣條件下，考察了HL對(duì)常見陰陽離子熒光光譜變化情況，結(jié)果見圖3。由圖3(A)可看出，在HL的溶液中加入Cu2+會(huì)使探針在435 nm的熒光顯著降低，其余本研究范圍內(nèi)的常見的金屬離子未表現(xiàn)出熒光特異性能。圖3(B)是HL與常見陰離子結(jié)合前后在435 nm處熒光強(qiáng)度對(duì)比。由圖3(B)可以看出在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)陰離子對(duì)HL無特異選擇性。因此，結(jié)合紫外-可見吸收光譜預(yù)示著目標(biāo)探針是一個(gè)對(duì)Cu2+具有特異選擇性熒光猝滅型Cu2+探針。

為此，可以說明目標(biāo)探針具有對(duì)Cu2+顯著熒光猝滅的“關(guān)”的識(shí)別功能。

(A)(1—HL; 2—Ag+; 3—Al3+; 4—Ba2+; 5—Ca2+; 6—Cd2+; 7—Ce4+; 8—Co2+; 9—Cu2+;10—Fe2+;11—Fe3+; 12—Hg2+;13—K+;14—La3+;15—Li+;16—Mg2+;17—Mn2+; 18—Na+; 19—Ni2+; 20—Pb2+; 21—Ru3+; 22—Th4+; 23—Zn2+)

(B)(1—HL;2—Ac-;3—Br-;4—C2O42-;5—Cl-; 6—ClO3-; 7—CO32-;8—H2PO42-;9—I-;10—IO4-;11—NO3-;12—S2-;13—S2O72-;14—SCN-;15—SO42-)

2.3 探針HL識(shí)別Cu2+條件

2.3.1 Cu2+濃度對(duì)探針HL熒光強(qiáng)度的影響

在HL(20 μmol/L)的二次蒸餾水溶液中，分別加入不同濃度的Cu2+，測(cè)定其熒光光譜，結(jié)果見圖4。由圖可見，不加Cu2+時(shí)，探針的熒光很強(qiáng)。隨著Cu2+濃度逐漸增大，HL在435 nm處的熒光強(qiáng)度大幅度減弱，這可能是由于二價(jià)銅離子是d9結(jié)構(gòu)的順磁性離子，具有極強(qiáng)的熒光猝滅性[14]，當(dāng)其與目標(biāo)分子配位后，使得原來剛性結(jié)夠發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，進(jìn)而猝滅目標(biāo)探針熒光。此外，當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，其熒光已猝滅到最小值，即使再增加濃度，其熒光強(qiáng)度改變值也非常小，故選擇HL與Cu2+的濃度為1∶1。

圖4 探針HL在加入Cu2+(0～20 μmol/L)后熒光光譜變化曲線Figure 4 Fluorescence spectral variation plot as Cu2+(0～20 μmol/L) was added to HL probe.

2.3.2 pH值對(duì)HL識(shí)別Cu2+的影響

我們研究了體系pH值對(duì)HL-Cu2+體系最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的影響，如圖5(A)，從圖中可以看出，探針HL-Cu2+體系在pH=6～10之間沒有

熒光，說明是目標(biāo)探針對(duì)Cu2+的選擇性識(shí)別可以在較寬的pH范圍內(nèi)進(jìn)行探測(cè)。而當(dāng)體系pH<6后，隨著酸度的增強(qiáng)，HL的熒光強(qiáng)度逐漸增加，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于在酸性較強(qiáng)的環(huán)境下C=N雙鍵極易發(fā)生斷裂[15]，進(jìn)而破壞掉原來的配位體系，使得熒光恢復(fù)所致。而當(dāng)pH大于11后熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)，這可能是由于隨著OH-增加，體系中Cu2+與OH-形成Cu(OH)2微溶物，破壞掉原有的配位體系所致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：探針HL在體系pH=6～10環(huán)境下不受質(zhì)子的影響，為具有較寬pH測(cè)試范圍的熒光猝滅型Cu2+分子探針。

2.3.3 時(shí)間對(duì)HL識(shí)別Cu2+的影響

室溫下，在HL(20 μmol/L)、Cu2+(20 μmol/L)的二次蒸餾水溶液中，測(cè)定化合物的時(shí)間和熒光強(qiáng)度的關(guān)系曲線示于圖5(B)。由圖5(B)可以看出：一開始加入Cu2+時(shí)就達(dá)到響應(yīng)平臺(tái)，隨著時(shí)間的推移RBS熒光強(qiáng)度變化不大，可認(rèn)為HL與Cu2+的絡(luò)合不受時(shí)間的影響。

2.4 HL-Cu2+體系對(duì)S2O72-識(shí)別研究

2.4.1 HL-Cu2+體系對(duì)陰離子選擇性識(shí)別

基于Cu(II)配位體系易與一些諸如S2-陰離子結(jié)合[16]，故提出探針熒光恢復(fù)這一設(shè)想，我們擬開發(fā)具有“關(guān)-開”型探針。為此，我們考察了常見十余種陰離子對(duì)HL-Cu2+體系的熒光恢復(fù)性能(如圖6所示)。結(jié)果表明，僅有S2O72-會(huì)使體系的紫外-可見光譜在385 nm處吸收峰消失，而在280 nm處吸收峰增加，這說明了焦硫酸根離子HL-Cu2+體系發(fā)生了作用，導(dǎo)致體系吸收光譜發(fā)生了顯著變化。而在十余種常見陰離子對(duì)HL-Cu2+體系的熒光恢復(fù)中，也只有S2O72-會(huì)使體系的熒光顯著恢復(fù)。

圖5 (A) pH對(duì)探針HL-Cu2+熒光強(qiáng)度的影響;(B) 時(shí)間對(duì)探針HL-Cu2+熒光強(qiáng)度的影響Figure 5 (A) Influence of pH on fluorescent intensity of the HL-Cu2+ probe;(B) Influence of time on fluorescent intensity of the HL-Cu2+ probe.

圖6 (A) HL-Cu2+對(duì)常見陰離子的的紫外光譜; (B) HL-Cu2+對(duì)常見陰離子的熒光強(qiáng)度 Figure 6 (A) UV-vis spectra of common anions in the presence of HL-Cu2+ ;(B) Fluorescent intensities of common anions in the presence of HL-Cu2+ .

2.4.2 常見陰陽離子對(duì)HL-Cu2+識(shí)別S2O72-的影響

為考察常見陰陽離子對(duì)HL-Cu2+識(shí)別S2O72-的影響，在HL(20 μmol/L)、Cu2+(20 μmol/L)的二次蒸餾水溶液中，分別加入4倍于Cu2+濃度的常見陰陽離子溶液，結(jié)果示于圖7。由圖7可以看出，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)未有陽離子對(duì)HL-Cu2+識(shí)別S2O72-的熒光猝滅干擾。而常見陰離子僅有CO32-時(shí)目標(biāo)探針識(shí)別銅有顯著熒光猝滅干擾。據(jù)此，仍可以認(rèn)為HL-Cu2+具有對(duì)S2O72-高選擇性熒光增強(qiáng)識(shí)別能力。

((1—L-Cu2+-S2O72-; 2—Ag+; 3—Al3+; 4—Ba2+; 5—Ca2+; 6—Cd2+; 7—Ce4+; 8—Co2+; 9—Cu2+; 10—Fe2+; 11—Fe3+; 12—Hg2+; 13—K+; 14—La3+; 15—Li+; 16—Mg2+; 17—Mn2+; 18—Na+; 19—Ni2+; 20—Pb2+; 21—Ru3+; 22—Th4+; 23—Zn2+)

(1—Ac-;2—Br-;3—C2O42-;4—Cl-;5—ClO3-;6—CO32-;7—H2PO42-;8—I-;9—IO4-;10—NO3-;11—S2-;12—S2O72-;13—SCN-;14—SO42-)

3 結(jié)論

本研究基于以激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)而具有良好的光物理過程的苯并咪唑化合物為母核，通過其與水楊醛一步反應(yīng)簡(jiǎn)單制備得到具有多個(gè)氮氧配位原子的苯并咪唑化合物，并通過1H NMR、FT-IR、MS及元素分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證為預(yù)期目標(biāo)探針分子。通過紫外-可見光譜和熒光光譜研究其對(duì)常見金屬離子和陰離子選擇性識(shí)別性能。結(jié)果表明：Cu2+具有對(duì)目標(biāo)探針熒光猝滅作用，而S2O72-具有對(duì)該熒光猝滅體系熒光恢復(fù)作用，據(jù)此，提出了具有“關(guān)-開”雙功能的基于苯并咪唑的Cu2+、S2O72-的“關(guān)-開”型連續(xù)性熒光探針。

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