宋文婷 朱瑞蘭 余光勤 羅玉蘭 袁澤利

(遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義 563003)

0 前言

金屬離子和陰離子是一類重要的環(huán)境污染物，它們對人體健康存在著巨大的威脅，因而探尋這些物質(zhì)的檢測方法對生命、環(huán)境和醫(yī)學科學等領(lǐng)域都有著十分重要的意義[1]。例如：銅是生物體中基本的微量元素之一，但在生物體內(nèi)攝入過量的銅也會產(chǎn)生毒性，從而引起膽汁排泄銅的功能紊亂、慢性活動性肝炎、帕金森綜合癥、腎小管中毒等神經(jīng)性疾病[2-3]。而焦硫酸根離子(S2O72-)因其在生物和醫(yī)藥學方面的重要作用，而已有關(guān)于研究其致人死亡原因的探測報道[4]。人體攝取銅(II)和S2O72-的主要途徑是經(jīng)食物、水及環(huán)境，因此檢測食物或水中Cu2+的新分析方法在醫(yī)學等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。目前已經(jīng)發(fā)展有諸如分光光度法、電化學法、原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法等[5]方法應用于Cu2+的檢測研究，但這些研究方法存在著需要昂貴儀器和復雜的操作步驟[6-7]。熒光分析法具有靈敏度高、可實時檢測、對樣品基本無損傷且使用方便等優(yōu)點而正成為當前研究重金屬離子探測的方法之一[8]。當前已發(fā)展了一些具有進一步開發(fā)前景的Cu2+熒光探針[9-10]，但這些探針往往只能實現(xiàn)單一的探測功能，無法實現(xiàn)多功能或連續(xù)測試功能。為此，本研究基于以激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)而具有良好的光物理過程[11]的苯并咪唑化合物為母核，通過其與水楊醛一步反應簡單制備得到具有多個氮氧配位原子的苯并咪唑化合物(圖1)，并通過紫外-可見光譜和熒光光譜研究其對常見金屬離子和陰離子選擇性識別性能。研究結(jié)果表明：Cu2+具有對目標探針熒光猝滅作用，而S2O7-具有對該熒光猝滅體系熒光恢復作用。據(jù)此，提出了基于苯并咪唑的Cu2+，S2O7-的“關(guān)-開”型雙功能連續(xù)性熒光探針。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 5973氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；Varian 1000 FT-IR紅外光譜(KBr壓片，美國Varian公司)；MS HP-1100質(zhì)譜儀(德國 HP公司)；奧立龍868酸度計(美國奧立龍公司)；TU-1901雙光束紫外-可見分光光計(北京普析通用儀器有限責任公司)；VARIAN Cary Eclipse 熒光光度計(美國瓦里安公司)；BrukerAV-400型核磁共振儀(瑞士 Broker公司)。

所用試劑除鄰苯二胺為化學純外，其余均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 目標探針(HL)的合成

分別取胺甲基苯并咪唑和水楊醛各10 mmol溶解于30 mL無水乙醇中，于微波儀下微波反應30 min，冷卻過濾，收率為85.6%。MS(ESI)m/z：253[M++2]，理論計算值為251.1元素分析(理論)，C15H13N3O：C 71.70，H 5.21，N 16.72；檢測 C 71.23，H 5.56，N 16.58；1H NMR(DMSO-d6,ppm)：13.03(s，1H，OH)，11.85(s，1H，NH)，8.95(s，1H，CH=N)，7.43-8.17(m，8H，Ar-H)，3.36(s，2H，CH2)；FT-IR(cm-1)：3489，3414，3305，3143，1615，1590，1544，1406，1241，865，752，634。

圖1 HL的合成路線Figure 1 Synthetic route for HL.

1.3 溶液的配制

受體(L)標準溶液：準確稱取一定量的受體溶于二次雙蒸水中，制成濃度為2.0×10-5mol/L的儲備溶液，冷藏保存于冰箱，使用時根據(jù)需要適當稀釋。

常見金屬離子和陰離子標準溶液：準確稱取一定量的各金屬鹽和各陰離子鈉鹽或鉀鹽溶于二次雙蒸水中，制成濃度為1.0×10-3mol/L的儲備溶液，冰箱冷藏保存，使用時根據(jù)需要適當稀釋。

1.4 探針性能測試

先于10 mL容量瓶中加入5 mL二次雙蒸水，然后用微量進樣器加入一定體積的HL標準溶液，再加入一定體積的金屬離子或陰離子標準溶液，最后用二次雙蒸水稀釋定容至10 mL，搖勻并放置一定時間，測其紫外-可見光譜和熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標探針的結(jié)構(gòu)表征

在目標探針的1H NMR譜中，分別在13.03，11.85 ppm觀察到OH和NH的質(zhì)子化學位移，在8.95 ppm觀察到CH=N的特征質(zhì)子化學位移[12]說明目標探針的生成。此外，在7.43～8.17 ppm處為芳環(huán)的質(zhì)子化學位移。在目標探針的FT-IR譜中，在1615 cm-1也觀察到C=N特征振動吸收峰[13]，進一步驗證了目標探針的生成。結(jié)合元素分析和質(zhì)譜可以確定成功合成得到目標探針。

2.2 探針(HL)對Cu2+識別研究

2.2.1 紫外光譜考察探針對常見陰陽離子選擇性

探針HL(20 μmol/L)及其與常見金屬離子、陰離子(20 μmol/L)的紫外-可見吸收光譜示于圖2。由圖2可以看出，探針HL與Cu2+混合后其紫外吸收光譜發(fā)生了顯著變化，其在345 nm處產(chǎn)生了一個新的吸收峰，探針在280 nm處的吸收強度也發(fā)生了顯著的降低，說明了探針HL與Cu2+結(jié)合發(fā)生了作用。而目標探針對本研究范圍內(nèi)使用的常見陰離子無特異性選擇。

圖2 HL對常見金屬離子和陰離子的紫外光譜(A：HL與金屬離子;B：HL與陰離子) Figure 2 The UV-vis spectra of HL (A) with metal cations, such as Na+ or K+ salts; and (B) with anions, such as Cl- or NO3-.

2.2.2 熒光光譜考察探針對常見陰陽離子的選擇性

在同樣條件下，考察了HL對常見陰陽離子熒光光譜變化情況，結(jié)果見圖3。由圖3(A)可看出，在HL的溶液中加入Cu2+會使探針在435 nm的熒光顯著降低，其余本研究范圍內(nèi)的常見的金屬離子未表現(xiàn)出熒光特異性能。圖3(B)是HL與常見陰離子結(jié)合前后在435 nm處熒光強度對比。由圖3(B)可以看出在實驗范圍內(nèi)陰離子對HL無特異選擇性。因此，結(jié)合紫外-可見吸收光譜預示著目標探針是一個對Cu2+具有特異選擇性熒光猝滅型Cu2+探針。

為此，可以說明目標探針具有對Cu2+顯著熒光猝滅的“關(guān)”的識別功能。

(A)(1—HL; 2—Ag+; 3—Al3+; 4—Ba2+; 5—Ca2+; 6—Cd2+; 7—Ce4+; 8—Co2+; 9—Cu2+;10—Fe2+;11—Fe3+; 12—Hg2+;13—K+;14—La3+;15—Li+;16—Mg2+;17—Mn2+; 18—Na+; 19—Ni2+; 20—Pb2+; 21—Ru3+; 22—Th4+; 23—Zn2+)

(B)(1—HL;2—Ac-;3—Br-;4—C2O42-;5—Cl-; 6—ClO3-; 7—CO32-;8—H2PO42-;9—I-;10—IO4-;11—NO3-;12—S2-;13—S2O72-;14—SCN-;15—SO42-)

2.3 探針HL識別Cu2+條件

2.3.1 Cu2+濃度對探針HL熒光強度的影響

在HL(20 μmol/L)的二次蒸餾水溶液中，分別加入不同濃度的Cu2+，測定其熒光光譜，結(jié)果見圖4。由圖可見，不加Cu2+時，探針的熒光很強。隨著Cu2+濃度逐漸增大，HL在435 nm處的熒光強度大幅度減弱，這可能是由于二價銅離子是d9結(jié)構(gòu)的順磁性離子，具有極強的熒光猝滅性[14]，當其與目標分子配位后，使得原來剛性結(jié)夠發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，進而猝滅目標探針熒光。此外，當Cu2+濃度達到20 μmol/L時，其熒光已猝滅到最小值，即使再增加濃度，其熒光強度改變值也非常小，故選擇HL與Cu2+的濃度為1∶1。

圖4 探針HL在加入Cu2+(0～20 μmol/L)后熒光光譜變化曲線Figure 4 Fluorescence spectral variation plot as Cu2+(0～20 μmol/L) was added to HL probe.

2.3.2 pH值對HL識別Cu2+的影響

我們研究了體系pH值對HL-Cu2+體系最大發(fā)射波長處熒光強度的影響，如圖5(A)，從圖中可以看出，探針HL-Cu2+體系在pH=6～10之間沒有

熒光，說明是目標探針對Cu2+的選擇性識別可以在較寬的pH范圍內(nèi)進行探測。而當體系pH<6后，隨著酸度的增強，HL的熒光強度逐漸增加，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于在酸性較強的環(huán)境下C=N雙鍵極易發(fā)生斷裂[15]，進而破壞掉原來的配位體系，使得熒光恢復所致。而當pH大于11后熒光強度逐漸恢復，這可能是由于隨著OH-增加，體系中Cu2+與OH-形成Cu(OH)2微溶物，破壞掉原有的配位體系所致。實驗結(jié)果表明：探針HL在體系pH=6～10環(huán)境下不受質(zhì)子的影響，為具有較寬pH測試范圍的熒光猝滅型Cu2+分子探針。

2.3.3 時間對HL識別Cu2+的影響

室溫下，在HL(20 μmol/L)、Cu2+(20 μmol/L)的二次蒸餾水溶液中，測定化合物的時間和熒光強度的關(guān)系曲線示于圖5(B)。由圖5(B)可以看出：一開始加入Cu2+時就達到響應平臺，隨著時間的推移RBS熒光強度變化不大，可認為HL與Cu2+的絡合不受時間的影響。

2.4 HL-Cu2+體系對S2O72-識別研究

2.4.1 HL-Cu2+體系對陰離子選擇性識別

基于Cu(II)配位體系易與一些諸如S2-陰離子結(jié)合[16]，故提出探針熒光恢復這一設(shè)想，我們擬開發(fā)具有“關(guān)-開”型探針。為此，我們考察了常見十余種陰離子對HL-Cu2+體系的熒光恢復性能(如圖6所示)。結(jié)果表明，僅有S2O72-會使體系的紫外-可見光譜在385 nm處吸收峰消失，而在280 nm處吸收峰增加，這說明了焦硫酸根離子HL-Cu2+體系發(fā)生了作用，導致體系吸收光譜發(fā)生了顯著變化。而在十余種常見陰離子對HL-Cu2+體系的熒光恢復中，也只有S2O72-會使體系的熒光顯著恢復。

圖5 (A) pH對探針HL-Cu2+熒光強度的影響;(B) 時間對探針HL-Cu2+熒光強度的影響Figure 5 (A) Influence of pH on fluorescent intensity of the HL-Cu2+ probe;(B) Influence of time on fluorescent intensity of the HL-Cu2+ probe.

圖6 (A) HL-Cu2+對常見陰離子的的紫外光譜; (B) HL-Cu2+對常見陰離子的熒光強度 Figure 6 (A) UV-vis spectra of common anions in the presence of HL-Cu2+ ;(B) Fluorescent intensities of common anions in the presence of HL-Cu2+ .

2.4.2 常見陰陽離子對HL-Cu2+識別S2O72-的影響

為考察常見陰陽離子對HL-Cu2+識別S2O72-的影響，在HL(20 μmol/L)、Cu2+(20 μmol/L)的二次蒸餾水溶液中，分別加入4倍于Cu2+濃度的常見陰陽離子溶液，結(jié)果示于圖7。由圖7可以看出，在本實驗范圍內(nèi)未有陽離子對HL-Cu2+識別S2O72-的熒光猝滅干擾。而常見陰離子僅有CO32-時目標探針識別銅有顯著熒光猝滅干擾。據(jù)此，仍可以認為HL-Cu2+具有對S2O72-高選擇性熒光增強識別能力。

((1—L-Cu2+-S2O72-; 2—Ag+; 3—Al3+; 4—Ba2+; 5—Ca2+; 6—Cd2+; 7—Ce4+; 8—Co2+; 9—Cu2+; 10—Fe2+; 11—Fe3+; 12—Hg2+; 13—K+; 14—La3+; 15—Li+; 16—Mg2+; 17—Mn2+; 18—Na+; 19—Ni2+; 20—Pb2+; 21—Ru3+; 22—Th4+; 23—Zn2+)

(1—Ac-;2—Br-;3—C2O42-;4—Cl-;5—ClO3-;6—CO32-;7—H2PO42-;8—I-;9—IO4-;10—NO3-;11—S2-;12—S2O72-;13—SCN-;14—SO42-)

3 結(jié)論

本研究基于以激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)而具有良好的光物理過程的苯并咪唑化合物為母核，通過其與水楊醛一步反應簡單制備得到具有多個氮氧配位原子的苯并咪唑化合物，并通過1H NMR、FT-IR、MS及元素分析對其結(jié)構(gòu)進行了確證為預期目標探針分子。通過紫外-可見光譜和熒光光譜研究其對常見金屬離子和陰離子選擇性識別性能。結(jié)果表明：Cu2+具有對目標探針熒光猝滅作用，而S2O72-具有對該熒光猝滅體系熒光恢復作用，據(jù)此，提出了具有“關(guān)-開”雙功能的基于苯并咪唑的Cu2+、S2O72-的“關(guān)-開”型連續(xù)性熒光探針。

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