王長(zhǎng)文，馬洪波，張 鐸，趙文秀

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

我國(guó)產(chǎn)茶區(qū)分布廣，茶葉品種豐富，但對(duì)茶的成分和功效影響最大的是茶葉發(fā)酵程度。與非發(fā)酵茶比較，屬于發(fā)酵茶的紅茶糖類(lèi)含量相對(duì)高，組成與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[1]。茶多糖是由多種單糖和糖基組成，體外研究表明，茶多糖對(duì)物理和化學(xué)來(lái)源的活性氧(reactive oxygen species，ROS）具有清除作用。細(xì)菌等微生物感染后，單核巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞在細(xì)菌內(nèi)毒素等刺激下，可產(chǎn)生大量ROS[2]。炎癥反應(yīng)中免疫細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS可破壞胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白及細(xì)胞器；而釋放的ROS可導(dǎo)致肺泡和血管內(nèi)皮等組織細(xì)胞的損傷[3]。茶多糖是否可調(diào)節(jié)LPS活化單核巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平還未見(jiàn)報(bào)道，本研究將以單核細(xì)胞系的U937細(xì)胞為模型，分析茶多糖對(duì)ROS的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞 U937引自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC），液氮中凍存。

1.2 試驗(yàn)藥品 細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS），購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。異硫氰酸熒光素(fluo?rescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），購(gòu)自Sigma公司(美國(guó)）?；钚匝跆结橂p氯熒光黃乙酸乙酯（Dichlorofluo?rescin diacetate，DCFH-DA），購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。Annexin-V和PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自eBioscinedce公司(美國(guó)）。

1.3 試驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞儀為EPICS-XL型（美國(guó)貝克曼公司）。

1.4 茶多糖的提取、純化和標(biāo)記 以福建“正山小種”紅茶為原料，水浸泡的方式提取茶多糖，大孔樹(shù)脂層析法制備純化的紅茶多糖(black tea polysac?charides，bTPS）。并采用酪胺還原法標(biāo)記異硫氰酸熒 光 素(fluorescinisothiocyate，F(xiàn)ITC），制 備 FITC-bTPS。將bTPS和FITC-bTPS（按bTPS計(jì)算）溶于PBS，配制為2mg/mL的儲(chǔ)存液，分裝后-20℃保存。1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù) 復(fù)蘇U937細(xì)胞，以含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養(yǎng)。將細(xì)胞用培養(yǎng)液調(diào)為3×105/mL，按3mL孔接種于6孔板，加入不同濃度FITC-bTPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，收集細(xì)胞后通過(guò)檢測(cè)FITC的熒光分析bTPS與細(xì)胞的結(jié)合；用LPS（20 μg/mL）和FITC-bTPS（0、10、20 μg/mL和40μg/mL）同時(shí)處理細(xì)胞2 h，收集細(xì)胞后分析bTPS與細(xì)胞的結(jié)合。接種細(xì)胞，加入不同濃度的LPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。用LPS（0 μg/mL和20μg/mL）處理和bTPS（0μg/mL和20μg/mL）處理細(xì)胞4 h，分析細(xì)胞內(nèi)ROS和水平；并分析細(xì)胞凋亡。

1.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè) 收集細(xì)胞，用PBS調(diào)為密度2×106mL的細(xì)胞懸液，取500μL細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA儲(chǔ)存液，至其終濃度為5μmol/L，混勻后在37℃避光反應(yīng)30min，PBS洗2次后用流式細(xì)胞儀分析。

1.7 細(xì)胞凋亡分析 將細(xì)胞用PBS洗滌2次，用結(jié)合緩沖液調(diào)為2×106/mL的細(xì)胞懸液。取190μL細(xì)胞懸液，加入10μL FITC-標(biāo)記Annexin-V，室溫下避光反應(yīng)15min；離心棄上清，加入結(jié)合緩沖液500 μL，再次洗滌后，475μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，接入PI溶液25μL，混勻后立即用流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多糖與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合U937細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)分析表明，F(xiàn)ITC-bTPS可與U937細(xì)胞結(jié)合，熒光強(qiáng)度的均值代表細(xì)胞膜表面結(jié)合FITC-bTPS的相對(duì)量。與空白對(duì)照組比較（圖1A），相同處理時(shí)間，熒光強(qiáng)度均值伴茶多糖濃度增加而增加（圖1B～E）。來(lái)自植物、動(dòng)物和微生物的多糖可與細(xì)胞膜的Toll樣受體家族結(jié)合，主要是TLT2、TLR4和TLR7等，即它們?cè)诩?xì)胞膜表面有共同的受體。為研究茶多糖是否與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合U937表面的受體，將20μg/mL的LPS和不同濃度的FITC-bTPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL）同時(shí)處理細(xì)胞，分析熒光強(qiáng)度。LPS同時(shí)處理?xiàng)l件下，F(xiàn)ITC熒光強(qiáng)度仍以濃度依賴(lài)的方式增加，但顯著低于FITC-bTPS單獨(dú)作用組（圖F～I(xiàn)）。該結(jié)果表明，茶多糖和LPS可競(jìng)爭(zhēng)與U937細(xì)胞結(jié)合，提示兩者有共同的受體。

圖1 茶多糖與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合U937細(xì)胞

2.2 茶多糖和LPS對(duì)U937細(xì)胞ROS的影響 單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞表面與LPS結(jié)合的主要是TLR4，LPS與TLR4結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞活化、細(xì)胞內(nèi)活性氧增加。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為DCFH，該物質(zhì)被氧化后生成DCF，而DCF發(fā)射的熒光可采用流式細(xì)胞儀525 nm通道(FL1）來(lái)檢測(cè),其熒光強(qiáng)度值代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平。我們發(fā)現(xiàn)，U937細(xì)胞內(nèi)的ROS隨LPS濃度增加而增加（圖2A～D）。不同濃度未標(biāo)記的茶多糖（bTPS）與20μg/mL的LPS處理細(xì)胞后，LPS所激發(fā)的ROS水平逐漸隨bTPS濃度增加而減少（圖2E～H）。該研究結(jié)果提示，茶多糖可能通過(guò)與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合U937細(xì)胞而降低細(xì)胞內(nèi)過(guò)量ROS的產(chǎn)生。

圖2 茶多糖和LPS對(duì)U937細(xì)胞ROS的影響

2.3 茶多糖和LPS對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響 過(guò)量的ROS可使細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死和自噬等改變，導(dǎo)致組織損傷。為分析茶多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否有影響，采用Annexin-V和PI雙染法檢測(cè)茶多糖和LPS處理后U937細(xì)胞亡的情況。與對(duì)照組比較（圖3A），20μg/mL的LPS可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生早期凋亡、晚期凋亡和壞死（圖3B）；20μg/mL茶多糖處理后，細(xì)胞無(wú)顯著凋亡和壞死（圖3C）；與LPS單獨(dú)處理組比較，兩者共同作用組晚期凋亡和壞死細(xì)胞顯著減少（圖3D）。

圖3 茶多糖和LPS對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

研究表明，茶多糖具有多種生物活性，日常飲茶或攝入茶多糖有助于延緩衰老、預(yù)防心血管疾病和預(yù)防輻射損傷[4-5]。茶多糖成為茶葉中極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的生物活性物質(zhì)，有必要深入了解其作用機(jī)制，以推動(dòng)其應(yīng)用。本研究證實(shí)發(fā)酵茶多糖可與單核細(xì)胞結(jié)合，并揭示了茶多糖可與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞膜表面受體。在細(xì)菌內(nèi)毒素刺激下，免疫細(xì)胞活化后產(chǎn)生ROS而殺傷細(xì)菌,是機(jī)體抗感染免疫的一種效應(yīng)。但大量研究表明，過(guò)量的ROS導(dǎo)致感染后免疫細(xì)胞自身凋亡、壞死，并通過(guò)釋放游離的氧自由基，還導(dǎo)致組織損傷、細(xì)胞纖維化[6]。長(zhǎng)期慢性的感染，炎癥反應(yīng)所釋放的自由基還參與基因突變、誘發(fā)細(xì)胞癌變的過(guò)程。茶多糖具有抗氧化活性，但對(duì)其機(jī)制的深入研究較少，多限與其消除物理、化學(xué)法誘發(fā)ROS的炎癥。本研究結(jié)果提示，茶多糖可與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合單核細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，并減少LPS所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和壞死。茶多糖消除ROS的機(jī)制涉及多方面，包括其還原性多糖直接消除ROS等，全面了解茶多糖消除ROS的機(jī)制還需要深入研究。

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