（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

山東省濰坊市鴨病毒性肝炎的流行病學(xué)調(diào)查

朱俊平，薛 梅

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

為了解濰坊市鴨病毒性肝炎流行情況，從山東省濰坊市的昌邑、壽光、昌樂等9個(gè)市縣區(qū)發(fā)病嚴(yán)重的鴨場采集病料，采用雞胚尿囊腔接種法分離到22株病毒，經(jīng)雞胚中和試驗(yàn)和雛鴨血清保護(hù)試驗(yàn)，采集樣本中發(fā)現(xiàn)22株病毒為鴨肝炎病毒。其雞胚半數(shù)致死量（ELD50/0.2mL）均在10-5.9～10-5.4之間，平均為10-5.6。鴨病毒性肝炎在濰坊市的昌邑、壽光、昌樂等9個(gè)市縣區(qū)時(shí)常發(fā)生，該病雖一年四季均有發(fā)生，但春季和冬季出現(xiàn)的頻率略高。多個(gè)日齡的鴨均可感染發(fā)生鴨病毒性肝炎，但發(fā)病日齡相對集中在4～21日齡，且日齡越小，發(fā)病率和死亡率越高，4～7日齡的發(fā)病率和死亡率分別達(dá)50.9%和58.7%，是危害濰坊肉鴨養(yǎng)殖業(yè)最重要的疫病之一。

鴨病毒性肝炎；流行病學(xué)；調(diào)查

鴨病毒性肝炎（Duck Virus Hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（DHV）引起雛鴨的一種急性、高度致死性的傳染病，以角弓反張和肝炎為主要特征[1-3]。該病是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。為了解山東濰坊地區(qū)鴨病毒性肝炎的流行情況，并對其防控工作提供數(shù)據(jù)支持，我們從山東省濰坊地區(qū)的昌邑、壽光、昌樂、臨朐、安丘、寒亭、青州、高密、諸城等9個(gè)縣市區(qū)20個(gè)養(yǎng)鴨場開展流行病學(xué)調(diào)查，具體如下。

1 材料與方法

1.1 病料

采自患病或當(dāng)日死亡的疑似鴨病毒性肝炎病鴨的肝臟樣品[1]。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清

I型鴨肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：購自哈爾濱獸醫(yī)研究所維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 鴨及雞胚

10日齡SPF雞胚：購自山東斯帕法斯家禽有限公司；1日齡和3日齡無鴨病毒性肝炎抗體鴨：由濰坊樂港食品有限公司提供。

1.4 培養(yǎng)基

鮮血瓊脂培養(yǎng)基按郭霄峰提供的方法配制[2]。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品采集

從山東省濰坊地區(qū)的昌邑、壽光、昌樂、臨朐、安丘、寒亭、青州、高密、諸城等9個(gè)縣市區(qū)20

個(gè)養(yǎng)鴨場30個(gè)疑似鴨病毒性肝炎的病鴨群中無菌采集病鴨的肝臟，各分成2份，1份樣品用于細(xì)菌學(xué)檢測，4℃保存?zhèn)溆茫?份樣品用于病毒分離鑒定，-20℃冷凍保存。記錄疑似鴨病毒性肝炎的病鴨群所在地、日齡、發(fā)病率、死亡率、免疫情況、發(fā)生季節(jié)等情況。采樣時(shí)間為2012年1月到2012年12月。

2.2 樣品的病毒分離鑒定

2.2.1 樣品的細(xì)菌學(xué)檢測

2.2.1.1 樣品的觸片、染色、鏡檢[3-4]。取疑似鴨病毒性肝炎的病鴨的肝臟做觸片，分別進(jìn)行美蘭染色和革蘭氏染色；染色結(jié)束后，用顯微鏡觀察染色結(jié)果，并記錄有細(xì)菌存在的樣品數(shù)及細(xì)菌的染色結(jié)果。

2.2.1.2 樣品中細(xì)菌的分離培養(yǎng)。無菌取疑似鴨病毒性肝炎的病鴨的肝臟，接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，分別采取37℃厭氧培養(yǎng)和普通有氧培養(yǎng)24h。觀察培養(yǎng)結(jié)果并做記錄[5]。

2.2.1.3 統(tǒng)計(jì)樣品的細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果。

2.2.2 樣品的處理[6-8]

取無菌采集的疑似鴨病毒性肝炎的病鴨的肝臟，剪碎、研磨后，加入滅菌生理鹽水（pH6.8）制成20%（W/V）乳劑，反復(fù)凍融三次，加入青霉素、鏈霉素，使每毫升乳劑含青霉素、鏈霉素各1000單位，置4℃過夜，然后10000-12000r/min離心10min，取上清液用孔徑0.45um的細(xì)菌濾器過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 雞胚接種[9-10]

取10日齡SPF雞胚，通過照蛋標(biāo)出雞胚和氣室部位，然后分別用5%碘酊和75%酒精消毒氣室，干燥后用滅菌的打孔器打孔。然后將處理好的樣品的上清液，經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚，每胚接種0.2ml，每份樣品接種6枚雞胚，并設(shè)生理鹽水對照。用石蠟封孔后37℃繼續(xù)孵化，觀察3～6d，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，以后每天照胚3次，并及時(shí)將死亡的雞胚置4℃冰箱冷藏。收獲死亡胚尿囊液，取第1代死亡胚尿囊液再按同樣方法繼代5次，死亡胚尿囊液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 病毒鑒定

利用回歸試驗(yàn)、雞胚中和試驗(yàn)和雛鴨保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行病毒的鑒定

2.2.4.1回歸試驗(yàn)[10-11]。取1日齡無鴨病毒性肝炎抗體鴨12只，平均分成2組，試驗(yàn)組頸背部皮下注射病料乳劑0.2ml、對照組頸背部皮下注射生理鹽水0.2ml。2組鴨均隔離飼養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病死亡情況；死亡鴨進(jìn)行解剖，并記錄剖檢病理變化。

2.2.4.2 雞胚中和試驗(yàn)[10，12-13]。將收獲第5代尿囊液作1∶10稀釋，與I型鴨肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清等體積混和，37℃下作用1h，然后分別給試驗(yàn)組、對照組SPF雞胚尿囊腔接種傳代尿囊液稀釋液和I型鴨肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的混合液、傳代尿囊液稀釋液，每胚接種0.2ml，每組接種6枚雞胚。接種后繼續(xù)孵化，觀察記錄雞胚死亡情況。

2.2.4.3 雛鴨保護(hù)試驗(yàn)[11]。取3日齡無鴨病毒性肝炎抗體鴨18只，平均分成3組。其中試驗(yàn)組頸背部皮下注射I型鴨肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，每只2 ml，對照組不注射。24h后試驗(yàn)組和對照組1頸背部皮下注射傳代尿囊液0.2ml/只，對照組2頸背部皮下注射生理鹽水0.2ml/只。3組鴨分別隔離飼養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病死亡情況。

2.2.4.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)回歸試驗(yàn)、雞胚中和試驗(yàn)、雛鴨保護(hù)試驗(yàn)陽性的樣品（即含鴨病毒性肝炎病毒株的樣品）的數(shù)量。

2.3 鴨肝炎病毒分離株的毒力測定

2.3.1 鴨肝炎病毒分離株雞胚半數(shù)致死量（ELD50）的測定[14-15]

將分離株第5代尿囊液分別按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7進(jìn)行倍比稀釋，然后接種SPF雞胚，每胚接種0.2ml，每個(gè)稀釋度接種6枚，同時(shí)設(shè)立空白對照組。接種后8h照蛋一次，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，記錄雞胚每天死亡情況，6d后累計(jì)所有結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算出ELD50。

2.3.2 各鴨肝炎病毒分離株毒力測定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 樣品的病毒分離鑒定結(jié)果

3.1.1 雞胚接種結(jié)果

雞胚接種經(jīng)無菌處理的樣品后，能使雞胚在

24h ～144h內(nèi)死亡的樣品數(shù)是22個(gè)，占樣品總數(shù)的73.3%。多數(shù)死亡雞胚發(fā)育不良或水腫，全身出血，尤其是胚的頭部和腳爪出血嚴(yán)重，剖檢呈現(xiàn)肝臟點(diǎn)狀出血或斑狀出血。繼代3～4次后，胚體表現(xiàn)規(guī)律性死亡，死亡時(shí)間基本集中在36h ～72h之間。

3.1.2 回歸試驗(yàn)

發(fā)病死亡鴨多在注射樣品后第2～4d發(fā)病死亡，初期表現(xiàn)為精神沉郁，厭食。繼而大多數(shù)病鴨出現(xiàn)角弓反張，多幾分鐘至半天內(nèi)死亡。發(fā)病死亡鴨的剖檢病理變化，主要病變器官是肝臟，大多數(shù)肝臟腫脹、出血。結(jié)果見表1。

表1回歸試驗(yàn)結(jié)果

3.2.3 雞胚中和試驗(yàn)結(jié)果

表2雞胚中和試驗(yàn)結(jié)果

3.2.4 雛鴨保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

表3雛鴨保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

3.3 鴨肝炎病毒分離株的毒力測定結(jié)果

從表4可以看出，所分離到的22株鴨肝炎病毒分離株的雞胚半數(shù)致死量（ELD50/0.2ml）均在10-5.9～10-5.4之間，平均為10-5.65。

3.4 確診鴨群有關(guān)情況的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

從表6中可以看出：確診為鴨病毒性肝炎的病鴨群存在于濰坊市的各縣市區(qū)，其中昌邑2群、壽光2群、昌樂4群、臨朐3群、安丘3群、寒亭3群、青州2群、高密2群、諸城1群。

從表7可以看出：鴨病毒性肝炎在濰坊市一年四季均可發(fā)生，春季和冬季出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)較高。

從表6和表8可以看出：多個(gè)日齡的鴨均可發(fā)生鴨病毒性肝炎，最小發(fā)病日齡是5日齡，最大發(fā)病日齡是29日齡，發(fā)生鴨病毒性肝炎的頻率高的日齡段是4～7日齡和8～14日齡。病鴨群發(fā)病率最高可達(dá)64.0%、最低3.9%，病死率最高可達(dá)76.8%、最低8.6%，各日齡段發(fā)病鴨群的發(fā)病率和死亡率最高的是4～7日齡、次之是8～14日齡。

表4 22株鴨肝炎病毒分離株的毒力測定結(jié)果

4 討論

4.1 山東省濰坊地區(qū)2012年30個(gè)疑似鴨病毒性肝炎的病鴨群中，存在細(xì)菌感染的病鴨群超過36.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了我們2004年調(diào)查所得的26%[19]，由此可見，混合感染已經(jīng)成為養(yǎng)鴨業(yè)中一個(gè)越來越值得重視的問題[16-18]。

4.2 雞胚接種經(jīng)無菌處理的樣品后，能使雞胚死亡的樣品數(shù)是22個(gè)；無鴨病毒性肝炎抗體鴨注射經(jīng)無菌處理的樣品后，能使鴨死亡的樣品數(shù)是22個(gè)；接種傳代尿囊液稀釋液后，有22組的雞胚出現(xiàn)死亡，而血清保護(hù)雞胚組數(shù)是22組；雛鴨保護(hù)試驗(yàn)血清保護(hù)了22組鴨。

由此可以得出這樣的結(jié)論：30個(gè)樣品中有22個(gè)個(gè)樣品所感染鴨肝炎病毒。

22株鴨肝炎病毒分離株的毒力測定結(jié)果表明：22株分離毒的雞胚半數(shù)致死量（ELD50/0.2ml）均在10-5.9～10-5．4之間，平均為10-5.65，略高于山東某些地區(qū)所分離毒株[14]，也基本一致。

表5鴨病毒性肝炎病鴨群的有關(guān)情況

表6確診為鴨病毒性肝炎的各病鴨群的地域分布

表7濰坊地區(qū)2012年鴨病毒性肝炎在不同季節(jié)發(fā)病的頻率

表8確診為鴨病毒性肝炎的各病鴨群的發(fā)病日齡分布、平均發(fā)病率、平均死亡率等指標(biāo)

4.3 鴨病毒性肝炎一年四季均可發(fā)生，春季和冬季出現(xiàn)的頻率明顯高于夏季和秋季。這可能與濰坊地區(qū)冬春季節(jié)氣溫低，風(fēng)大及鴨肝炎病毒在外界環(huán)境存活時(shí)間長有關(guān)[20]。

4.4 多個(gè)日齡的鴨均可發(fā)生鴨病毒性肝炎，發(fā)生頻率高的日齡段是4～7日齡和8～14日齡，且發(fā)病日齡越小，發(fā)病率和死亡率越高，4～7日齡的發(fā)病率和死亡率分別是50.9%和58.7%。這可能與種蛋的母源抗體低及消毒措施不力等因素有關(guān)。因此，加強(qiáng)消毒等措施，提高雛鴨母源抗體水平，對控制和減少鴨病毒性肝炎的發(fā)生具有重要意義[16-18]。2012年此數(shù)據(jù)低于作者2004年調(diào)查所得4～7日齡74.6%的發(fā)病率和75.0%的死亡率[19]，可能與近年來飼養(yǎng)管理水平的提高和防疫措施的加強(qiáng)有關(guān)。

4.5 鴨病毒性肝炎在濰坊市的9個(gè)市縣區(qū)都常發(fā)生。昌樂的發(fā)病率最高，與這些地方養(yǎng)鴨時(shí)間長、鴨場密度大、鴨舍簡陋、污染嚴(yán)重有關(guān)；諸城的發(fā)病率低與這些地方鴨場布局合理、鴨舍標(biāo)準(zhǔn)高、注重消毒有關(guān)。昌邑的2012年的發(fā)病率與我們2004年調(diào)查所得下降明顯[19]，可能與改建鴨舍，提高了鴨舍標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)了生物安全措施有關(guān)[18]。

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Epidemiological Investigation of Duck Viral Hepatitis in Weifang，Shandong Province

Zhu Junping，Xue Mei

（Shandong Vocational College of Animal Science and Veterinary Medicine，Weifang，Shandong 261061）

Twenty-two virus isolates were abtained from infected ducks in 9 cities and counties of Weifang using specifc pathogen free（SPF）chick embryos and all were confrmed as duck hepatitis virus（DHV）by chick embryos neutralization test and serum protection test of young duck. ELD50of the isolates ranged from 10-5.9to 10-5.4with the average of 10-5.65. The epidemiological results showed that DVH often appeared in 9 cities and counties of Weifang. DVH could infect ducks of different ages in all seasons，but it was most common in spring or winter and 4-21-day-old ducks were more easily infected. The younger the ducks，the higher the morbidity and the mortality were and the morbidity and mortality in 4-7-day-old ducks was up to 50.9% and 58.7% respectively.

duck viral hepatitis；epidemiological investigation；morbidity；mortality；Weifang

S852.65

：A

：1005-944X（2014）12-0050-05

薛梅