趙偉

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 新疆 烏魯木齊 830000）

膀胱癌是臨床中最為常見的一種泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重危害人們健康[1]。p21 激活酶2（PAK2）是PAK 家族重要成員，PAK 家族在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂凋亡等過程中起到了重要作用[2]。通過免疫組織化學(xué)法對(duì)膀胱癌組織及癌旁組織中PAK2 表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，旨在分析其與臨床病理特征的關(guān)系，及其對(duì)癌細(xì)胞活性的影響。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取醫(yī)院2018 年1 月—2020 年4 月接受手術(shù)治療的膀胱癌患者68 例，均為尿路上皮癌。手術(shù)切除患者膀胱癌組織及癌旁組織分別作為膀胱癌組和癌旁組。詳細(xì)收集患者的一般資料，主要包括年齡、性別、TNM 分期、組織分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。68 例患者中，男性47 例，女性21 例；年齡52 ～78 歲，平均年齡（62.09±5.46）歲。

1.2 方法

1.2.1 PAK2 陽(yáng)性率檢測(cè) 通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織PAK2 陽(yáng)性率，取甲醛溶液固定膀胱癌組織和癌旁組織，開展石蠟包埋和連續(xù)切片（厚度4mm），再實(shí)施常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水處理，用3%過氧化氫封閉處理內(nèi)源性過氧化物酶，并對(duì)標(biāo)本實(shí)施常規(guī)脫蠟，再開展微波抗原修復(fù)，于10%山羊血清封閉組織內(nèi)加入非特異性抗原開展操作，并加入適量兔抗人ER 和PR 抗體，抗體均購(gòu)自南京福麥斯生物科技有限公司，在4℃的冰箱內(nèi)孵育24h，用PBS 緩沖溶液替代一抗作陰性對(duì)照；同時(shí)，于次日滴加適量的羊抗兔二抗（PAK2 蛋白二抗均經(jīng)生物素標(biāo)記），實(shí)施SP（免疫組化）染色及DAB 顯色，用蘇木素實(shí)施復(fù)染，選擇中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察，將已知的膀胱癌陽(yáng)性切片視作陽(yáng)性對(duì)照。于400 倍顯微鏡下隨機(jī)選取視野5 個(gè)，觀察視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)、總細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過半定量積分法實(shí)施結(jié)果判定：①按每張切片內(nèi)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，無(wú)顯色計(jì)0 分，淺黃色染色計(jì)1 分，棕黃色染色計(jì)2 分，棕褐色染色計(jì)3 分。②按組織切片內(nèi)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)和總腫瘤細(xì)胞數(shù)的比值實(shí)施評(píng)分，若0 分：比值≤5%，1 分：＞5%～25%，2分：＞25%～50%，3 分：＞50%～75%，4 分：比值＞75%。將上述兩項(xiàng)評(píng)分相乘獲取總評(píng)分，總評(píng)分為0 分代表陰性（-），1 ～12 分代表陽(yáng)性。

1.2.2 Transwell 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移和侵襲能力 于低溫條件下將無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)制為1mg/ml 的Matrigel 膠溶液，均勻鋪于上室，每室為20μl，保存于溫箱中。向下室加入500μl甘油10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，用無(wú)牛清培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染CD511B 或者PAK2 質(zhì)粒的T24 細(xì)胞配制成為5×105/ml 細(xì)胞懸液，然后均勻覆蓋于膠上，每室約200μl，放置于二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱，溫度控制在37℃，時(shí)間為24h。將室內(nèi)液體傾去，再放置于4%多聚甲醛溶液中固定30min，溫度為室溫，在風(fēng)干之后取2%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，時(shí)間為30min，將聚碳脂膜內(nèi)側(cè)面的細(xì)胞擦去，于顯微鏡下對(duì)外側(cè)面細(xì)胞進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，對(duì)穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組各3 個(gè)復(fù)孔。遷移實(shí)驗(yàn)同上，無(wú)需放置Matrigel 膠，在細(xì)胞接種20h 之后進(jìn)行固定及染色，同樣各3 個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 膀胱癌組及癌旁組PAK2 表達(dá)水平比較

膀胱癌組PAK2 陽(yáng)性41 例（60.29%），顯著高于癌旁組的12 例（17.65%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.000，P＜0.05）。見圖1。

圖1 A：PAK2 在膀胱癌組織中的陰性表達(dá)；B：PAK2 在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)（×400）

2.2 膀胱癌患者臨床病理特征與PAK2 表達(dá)的關(guān)系

PAK2 在膀胱癌組織中的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P＞0.05），與TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 膀胱癌患者臨床病理特征與PAK2 表達(dá)的關(guān)系[n（%）]

2.3 過表達(dá)PAK2 對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

過表達(dá)MTA2 穩(wěn)轉(zhuǎn)T24 細(xì)胞侵襲以及遷移數(shù)目均顯著高于CD511B 穩(wěn)轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 過表達(dá)PAK2 對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

表2 過表達(dá)PAK2 對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

組別 侵襲數(shù)目 遷移數(shù)目CD511B 穩(wěn)轉(zhuǎn) 30.89±4.06 32.00±2.09 MTA2 穩(wěn)轉(zhuǎn) 51.94±4.15 65.00±6.72 t 6.280 8.122 P 0.000 0.000

3.討論

臨床中，大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要原因?yàn)椴≡钷D(zhuǎn)移及侵襲，因而了解癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義[3]。近年來，隨著分子檢測(cè)手段的不斷發(fā)展進(jìn)步，惡性腫瘤相關(guān)基因表達(dá)情況已經(jīng)成為臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。PAK2 廣泛存在機(jī)體各組織器官中，PAK2 具有獨(dú)特的作用，可以通過活化細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶加快細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以在細(xì)胞凋亡信號(hào)作用下引起細(xì)胞凋亡[4]。

眾多研究顯示，在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌以及乳腺癌等惡性腫瘤中PAK2 均呈高表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。本結(jié)果顯示，膀胱癌組PAK2 陽(yáng)性率顯著高于癌旁組，且與TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明PAK2 可以在一定程度上反映膀胱癌患者TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可作為患者病情進(jìn)展情況評(píng)估的重要指標(biāo)。

膀胱癌侵襲能力比較強(qiáng)，不過具體作用機(jī)制尚未完全明確。研究顯示，下調(diào)PAK2 表達(dá)可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。本文中，在膀胱癌T24 細(xì)胞系中過表達(dá)MTA2 之后，癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力均顯著增強(qiáng)[7]。其原因可能與通過PAK/MAPK/HSP27 信號(hào)通路活化、PAK2磷酸化等有關(guān)[8]，進(jìn)而發(fā)揮出促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，不過具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，膀胱癌組織中PAK2 陽(yáng)性表達(dá)率較高，與膀胱癌的發(fā)展相關(guān)，且可以促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲以及轉(zhuǎn)移。