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(1.興化市陶莊獸醫(yī)站,江蘇興化 225733;2.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇揚州 225009)
對一株鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定
徐榮妹1,劉金彪2
(1.興化市陶莊獸醫(yī)站,江蘇興化 225733;2.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇揚州 225009)
從江蘇興化地區(qū)某養(yǎng)鴨場的病鴨中采集樣本,經(jīng)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化檢測、凝集試驗及PCR檢測,分離到一株厭氧的革蘭氏陰性短桿菌,并被鑒定為11型鴨疫里默氏桿菌,定名為JY-58株。
鴨疫里默氏桿菌;分離;鑒定
鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的,主要侵害雛鴨等多種禽類的急性或慢性接觸性傳染病,該病呈急性或慢性敗血癥,常見癥狀為精神沉郁、流眼淚和流鼻液、輕度咳嗽、排綠色稀糞、共濟失調、頭頸震顫和昏迷。其特征性病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎[1]。鴨疫里默氏桿菌是一種革蘭氏陰性、無鞭毛、無芽孢的棒狀桿菌,瑞氏染色呈兩極著色。本病最早在1932年發(fā)現(xiàn)于美國紐約州的長島,其后在英國、加拿大、前蘇聯(lián)、澳大利亞等國亦有發(fā)生。我國于1982年首次報道本病的存在,各地均有發(fā)生,該病的發(fā)病率與死亡率都很高,是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。近年來,江蘇地區(qū)蛋鴨和肉鴨飼養(yǎng)發(fā)展迅速,一些養(yǎng)鴨場疑似鴨疫里默氏桿菌病時有發(fā)生,我們對江蘇興化某規(guī)?;B(yǎng)鴨場的病死鴨進行了細菌分離,并鑒定為11型RA,定名為JY-58株,旨在為江蘇省防制本病提供依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 病料。江蘇興化地區(qū)某規(guī)?;B(yǎng)鴨場發(fā)生較大規(guī)模傳染病。該養(yǎng)鴨場約有1萬只3周齡左右的雛鴨,發(fā)病100只,死亡28只,病鴨表現(xiàn)為倦怠、縮頸、不食或少食、眼鼻有分泌物、腹瀉、排淡綠色糞、行動遲緩、運動失調。無菌采取該鴨場病鴨肝臟,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 菌種。2型鴨疫里默氏桿菌(RA-2)取自揚州大學獸醫(yī)學院動物傳染病學實驗室。
1.1.3 試劑。LB培養(yǎng)基(OXOIDLTD,BASINGSTOKE,HAMPSHIRE,ENGLAND);血清(??寺∩锘瘜W制品有限公司);微量發(fā)酵管(杭州天和微生物試劑有限公司);Taq酶(晶美生物工程有限公司);dNTP(上海生工生物工程技術服務有限公司);瓊脂糖(基因技術(上海)有限公司);EB(美國BBI公司)。
1.2 方法
1.2.1 RA的分離。無菌條件下,用接種棒挑取病鴨肝臟組織,涂在血清LB平板上,厭氧培養(yǎng)(厭氧罐,并放入37℃溫箱);同時涂在麥康凱平板上,放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2 染色鏡檢。將血清LB平板上培養(yǎng)所得菌株分別進行瑞氏染色和革蘭氏染色,并置顯微鏡下觀察。
1.2.3 生化檢測。采用微量發(fā)酵管進行葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、尿素酶、H2S和硝酸鹽還原試驗;吲哚、M-R、V-P、過氧化氫酶試驗等參照文獻[2-3]進行;運動力測定采用半固體穿刺法,同時設RA-2作陽性對照。
1.2.4 凝集試驗。疑似菌株24h培養(yǎng)物按文獻介紹[4]的方法進行玻板凝集試驗,試驗用鴨疫里氏桿菌1型、2型、3型、11型陽性血清均由揚州大學獸醫(yī)學院動物傳染病學實驗室提供。
1.2.5 PCR鑒定及產(chǎn)物純化。根據(jù)國外發(fā)表的RA序列[5],用primer5.0設計軟件進行引物設計,用來擴增大約546bps大小的基因片段。上游引物(P1):5’–TTACCGACTGATTGCCTTCTAG 3;下游引物(P2):5’–AGAGGAAGACCGAGGACATC 3;引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
DNA的提?。罕緦嶒炇褂弥蠓蟹ㄌ崛NA。①吸取分離株細菌液100μL,12000r/min離心5min;②去上清,加100μL超純水重懸,離心,12000r/min,5min,重復3次;③加封口膜煮沸10min,冰浴10min;④12000r/min離心5min,取上清,作為模板DNA。
PCR反應體系:在25μL反應體系中進行PCR擴 增。2.5μL 10×Ex Taq Buffer,2μL 模板DNA,0.5μL TaqDNA,0.5μL上 游引物,0.5μL下游引物,17μL dH2O,0.5μL dNTP, 1.5μL Mg2+,總量25μL;反應條件:95℃預變性4min;95℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,30個循環(huán);最后72℃延伸7min,4℃保存。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,以核苷酸分子量DNA Marker 200確定目的條帶的大小。
2.1 染色鏡檢
分離菌株經(jīng)瑞氏染色,略呈兩極著色,為兩極濃染的小桿菌;革蘭氏染色呈陰性細小短桿菌,單個或成對分布。
2.2 生化檢測
分離株生化檢測結果顯示:RA-2和JY-58分離物均不能發(fā)酵糖(-),皆能液化明膠(+),且分離物對過氧化氫酶分解都表現(xiàn)為陽性,其余各項全為陰性,基本符合RA的特征(表1)。
表1 分離菌株的生化檢測結果
2.3 玻板凝集試驗
該分離株與標準陽性血清進行反應,對11型陽性血清為明顯凝集,鑒定為鴨疫里默氏桿菌11型(表2)。
表2 分離株玻板凝集試驗結果
2.4 PCR檢測結果
結果表明:RA-2株及JY-58菌株進行PCR擴增后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,均出現(xiàn)600 bps左右大小的目的片段(圖1),與預期大小基本相符。因此基本確定其為鴨疫里默氏桿菌。
圖1 PCR檢測結果
目前,鴨疫里氏桿菌感染呈全球性流行是造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟損失的最主要傳染病之一,其血清型呈多樣性,已經(jīng)報道的有21個血清型,不同的血清型間缺少交叉保護,加之用藥治療易產(chǎn)生耐藥性,這給我國RA病的防控帶來了很大困難。羊建中等在江蘇蘇中地區(qū)12家發(fā)病鴨場中分離到5種血清型的RA及未定型RA,證實該地區(qū)RA至少存在5種血清型,血清1、2、3型為主要血清型[4]。云水麗等在江蘇新沂地區(qū)的病鴨體內(nèi)分離到一株細菌,經(jīng)病原分離鑒定證實為血清11型RA[1]。本試驗是從江蘇興化地區(qū)的病鴨體內(nèi)分離到一株細菌,鑒定為血清11型RA,與云水麗等報道的血清型一致,證明血清11型RA為目前該地區(qū)的主要血清型。如對該分離菌株進行進一步的生物學特性、毒力、最小致病力等方面的研究,研制針對該血清型的滅活疫苗對該病的預防控制具有重要意義[6]。
[1] 云水麗,楊勇,王小波,等.11型鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及致病性研究[J].中國預防獸醫(yī)學報,2009,31(8):605-609.
[2] 姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,2001:126-127.
[3] 董渝,李文楊,程龍飛,等.3株鴨疫里默氏菌血清型鑒定及其生化特性的比較[J].福建農(nóng)業(yè)大學學報,2000,29(1) :87-89.
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[6] 王曉麗,王永明,龍冬,等.一例鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2009(4):18.
Isolation and identifcation of a strain of Riemerella anatipestifer
Xu Rongmei1,Liu Jinbiao2
(1. Taozhuang Veterinary Station of Xinghua City,Jiangsu 225733;2. College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225009)
Samples were collected from ill ducks in a duck farm in Xinghua area,Jiangsu province,and a strain of anaerobic gram-negative bacterium was obtained through isolation and culture,staining,biochemical test,agglutination test and PCR test,which was identifed as serotype 11 Riemerella anatipestifer,named as JY-58 strain.
Riemerella anatipestifer;isolation;identifcation
S852.615;S858.32
:B
:1005-944X(2014)08-0077-03
江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目
劉金彪