李 巖，吳愛萍，周海英，呂 錚，高 楊，任淑華

(1唐山市工人醫(yī)院，河北唐山063000;2河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肺癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率很高，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的70%～80%，且70%以上的患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，即使采用放、化療等綜合治療仍不能提高其生存率。最近研究表明，上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展(尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其可能是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素，且與腫瘤干細(xì)胞、腫瘤放化療抵抗和耐藥密切相關(guān)［1］。Ras同源物GTP酶(Rho)信號(hào)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，現(xiàn)已證實(shí)，其下游特征性效應(yīng)器Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)參與細(xì)胞的收縮、遷移、增殖和凋亡等過程［2，3］。2012年，我們觀察了ROCK阻斷劑Y-27632對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)介導(dǎo)的NSCLC A549細(xì)胞EMT的調(diào)節(jié)作用，旨在探討Y-27632對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT的抑制作用，為開發(fā)新的腫瘤抑制藥物Y-27632提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC A549細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，Y-27632購自Cayman chemica公司，TGF-β1購自Peprotech公司;E-鈣黏蛋白一抗、波形蛋白一抗、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)一抗、ROCK-I一抗購自Epitomics公司;血清應(yīng)答因子(SRF)一抗、心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-A(MATF-A)一抗購自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞誘導(dǎo)與分組 A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)并傳代，待細(xì)胞密度為60%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組在含0.2%FBS的DMEM培養(yǎng)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn);TGF-β1組在含0.2%FBS的DMEM培養(yǎng)條件下，加入5 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo);Y-27632組在含0.2%FBS的DMEM培養(yǎng)條件下，先給予Y-27632 10 μmol預(yù)孵育1 h，再加入5 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)［4］。在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察并拍照。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將細(xì)胞按2× 104/孔種植于24孔板，待次融合狀態(tài)后，用200μL槍頭在其孔中央輕輕劃痕，每組8孔，48 h后在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察并拍照。采用IPP 6.0圖像分析軟件測(cè)算劃痕區(qū)面積，計(jì)算遷移率，遷移率越高，遷移能力越強(qiáng)。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)波形蛋白、α-SMA表達(dá) 常規(guī)制備細(xì)胞爬片［5］，采用枸櫞酸鹽高壓熱修復(fù)，波形蛋白一抗、α-SMA一抗稀釋比例為1∶300，4℃過夜;二抗37℃孵育20 min，鏡下控制DAB顯色，輕度復(fù)染。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)E-鈣黏蛋白、波形蛋白、α-SMA、ROCK、SRF、MATF-A表達(dá) 采用RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法檢測(cè)各蛋白水平，按照50μg/泳道上樣，常規(guī)行電泳及電轉(zhuǎn)。一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1 h，行BCIP/NET顯色，至出現(xiàn)明顯條帶后用純水終止。采用IPP 6.0圖像分析軟件計(jì)算條帶平均光密度值(OD)，經(jīng)內(nèi)參平衡后作為蛋白的定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組EMT 中A549細(xì)胞的形態(tài)變化和遷移率比較 對(duì)照組作用48 h后，A549細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，細(xì)胞連接緊密，折光性強(qiáng)。TGF-β1組誘導(dǎo)48 h后，A549細(xì)胞形態(tài)由原來的鋪路石樣變?yōu)殚L梭樣或紡錘體形，細(xì)胞連接消失，間隔增大，細(xì)胞間呈離散趨勢(shì)，并隨時(shí)間延長而變化顯著。Y-27632組干預(yù)后能顯著抑制上述A549細(xì)胞變化，細(xì)胞形態(tài)基本保持原來形態(tài)，細(xì)胞間具有折光性強(qiáng)的細(xì)胞連接，細(xì)胞相互融合，呈鋪路石樣。3組A549細(xì)胞遷移率比較見表1。

表1 各組EMT中A549細(xì)胞遷移率比較(%，±s)

表1 各組EMT中A549細(xì)胞遷移率比較(%，±s)

注:與對(duì)照組同期比較，*P＜0.05;與TGF-β1組同期比較，#P＜0.05

組別A549細(xì)胞遷移率24 h 48 h對(duì)照組30.33±5.09 64.17±4.88 TGF-β1組 60.83±5.27* 87.67±3.33* Y-27632組 41.83±4.02# 77.17±3.43#

2.2 3組EMT中A549細(xì)胞的波形蛋白、α-SMA、E-鈣黏蛋白表達(dá)比較 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，對(duì)照組無波形蛋白、α-SMA陽性表達(dá)，TGF-β1組可見波形蛋白、α-SMA陽性表達(dá)，Y-27632組能抑制波形蛋白、α-SMA陽性表達(dá)。Western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1組E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，波形蛋白、α-SMA表達(dá)上調(diào)(P均＜0.05)。與TGF-β1組比較，Y-27632組E-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，波形蛋白、α-SMA表達(dá)下調(diào)，分別是TGF-β1組的52.05%、55.65%(P均＜0.05)。見表2。

表2 3組EMT中A549細(xì)胞各蛋白表達(dá)水平比較(OD，±s)

表2 3組EMT中A549細(xì)胞各蛋白表達(dá)水平比較(OD，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與TGF-β1組比較，#P＜0.05

組別 E-鈣黏蛋白 波形蛋白 α-SMA ROCK SRF MATF-A對(duì)照組 0.48±0.04 0.25±0.06 0.80±0.20 0.18±0.03 0.36±0.11 0.25±0.04 TGF-β1組 0.19±0.06* 0.73±0.19* 2.48±0.56* 0.66±0.24* 0.83±0.09* 0.84±0.27* Y-27632組 0.38±0.09# 0.38±0.09# 1.38±0.30# 0.29±0.03# 0.46±0.14# 0.37±0.03#

2.3 3組EMT中A549細(xì)胞ROCK、SRF、MATF-A表達(dá)比較 Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β1組能活化ROCK、SRF、MATF-A表達(dá)，其表達(dá)分別是對(duì)照組的3.67、2.31和3.36倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);而Y-27632組則能下調(diào)ROCK、SRF、MATF-A表達(dá)，其表達(dá)分別是 TGF-β1組的0.44、0.55和0.44倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

3 討論

目前研究認(rèn)為，EMT是腫瘤上皮細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，是上皮細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)、遷移能力的主要調(diào)控手段。EMT的主要特征為上皮標(biāo)記物如E-鈣黏蛋白等表達(dá)缺失或異位表達(dá)，而間質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白、α-SMA等出現(xiàn)或表達(dá)上調(diào);上皮細(xì)胞失去原有極性，由頂—底極性變?yōu)榍啊髽O性，即具有遷移的能力;體外培養(yǎng)可見上皮細(xì)胞由鋪路石樣變?yōu)樗笮蔚某衫w維細(xì)胞樣形態(tài)，伴有偽足形成［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)后A549細(xì)胞連接消失，細(xì)胞形態(tài)由鋪路石樣變?yōu)殚L梭形，同時(shí)遷移能力提高，E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，波形蛋白、α-SMA表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道［6］相似，提示TGF-β1能顯著促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT。

有研究顯示，ROCK在誘導(dǎo)細(xì)胞張力纖維絲形成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其能促進(jìn)球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)聚合為纖維狀肌動(dòng)蛋白，解聚MATF-A與G-actin的復(fù)合物，促進(jìn) MATF-A轉(zhuǎn)位入核，作為SRF的轉(zhuǎn)錄輔因子，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并促進(jìn)其靶基因α-SMA轉(zhuǎn)錄［7］。在腫瘤細(xì)胞中，SRF過表達(dá)能使腫瘤上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲;基因沉默或下調(diào)SRF表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移力、侵襲力和運(yùn)動(dòng)力［8，9］;針對(duì)SRF及其轉(zhuǎn)錄輔因子MRTF-A的siRNA能通過下調(diào)細(xì)胞的擴(kuò)散、黏附和運(yùn)動(dòng)能力，減少腫瘤細(xì)胞的惡性潛能［10］。提示ROCK介導(dǎo)的SRF/MATF-A轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的重要機(jī)制之一，阻斷ROCK可能對(duì)EMT發(fā)生具有一定抑制作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，Y-27632具有多種藥理學(xué)作用，包括平喘、降壓、抗炎，以及對(duì)缺血再灌注損傷、神經(jīng)系統(tǒng)疾患的抑制作用，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡、黏附、遷移也有抑制作用［4，11］。本研究顯示，Y-27632干預(yù)后能通過阻斷ROCK/SRF/MATF-A調(diào)控的間質(zhì)表型表達(dá)，抑制TGF-β1介導(dǎo)的A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程，提示Y-27632可能具有潛在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

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