陳哲++楊思思（等）

[摘要] 目的 比較四妙丸和甲氨蝶呤對(duì)高脂飼料膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠的影響，明確四妙丸對(duì)關(guān)節(jié)炎和血脂的影響。 方法 選用Wistar大鼠建立高脂飼料的關(guān)節(jié)炎模型，觀察四妙丸和甲氨蝶呤兩種治療4周后大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分、滑膜HE染色以及檢測(cè)血清中血脂和炎癥因子的濃度。 結(jié)果 CIA大鼠經(jīng)甲氨蝶呤和四妙丸治療后關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分均明顯下降，病理切片的滑膜增生層次和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯改善。與甲氨蝶呤組比較，四妙丸組血清中總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低（P < 0.01），而高密度脂蛋白膽固醇則明顯升高（P < 0.01）；前炎癥因子腫瘤壞死因子-α濃度下降（P < 0.05），而白介素-17濃度則明顯升高（P < 0.05）。 結(jié)論 四妙丸可能兼具有抑制免疫和降低血脂的作用來(lái)阻止CIA的進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 四妙丸；高脂飼料；膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎；Wistar大鼠

[中圖分類號(hào)] R593.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（b）-0024-04

Effects of Simiao Pills on blood lipid and joints of high-fat diet collagen-induced arthritis rats

CHEN Zhe1 YANG Sisi2 WANG Yu1 LIU Yafei1 TU Shenghao1

1.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China； 2.Department of Comprehensive， Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China

[Abstract] Objective To determine the effects of Simiao Pills on arthritis and blood lipids by comparing the influences of Simiao Pills and Methotrexate （MTX） on high fat diet collagen-induced arthritis （CIA） rats. Methods The arthritis model was established with high fat diet in Wistar rats. The rat arthritis index points and synovial HE staining were observed after 4 weeks of Simiao Pills and MTX treatment as well as the concentration of serum lipids and inflammatory factors were detected. Results The arthritis index score of CIA rats decreased significantly in both MTX and Simiao Pills treatment group. The synovial proliferation level and infiltration of inflammatory cells significantly improved in pathological sections. In Simiao Pills group， the serum TC， LDL-C levels decreased significantly compared with that in MTX group （P < 0.01）， while the HDL-C level increased significantly （P < 0.01）； the concentration of proinflammatory cytokine factor TNF-α decreased （P < 0.05）， the concentration of IL-17 significantly increased （P < 0.05）. Conclusion Simiao Pills can both suppress the immune and lower the blood lipid to prevent the progress of CIA.

[Key words] Simiao Pills； High fat diet； Collagen-induced arthritis； Wistar rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)（rheumatoid arthritis，RA）是以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥及軟骨吸收和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形、功能的喪失。最近研究表明，RA患者心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，RA患者中急性心肌梗死概率較正常人提高約1.6倍，而RA患者的平均壽命較正常人群減少15～18年，心腦血管急性事件是導(dǎo)致RA患者死亡的主要原因[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肥胖和血脂異常的RA患者比例較正常人明顯增高，易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的傾向，可能是心血管事件死亡率增高的原因[2]。已有報(bào)道表明肥胖可明顯加重關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[3]。

RA屬中醫(yī)學(xué)痹證范疇，四妙丸具有清熱利濕之功效，臨床研究表明其治療活動(dòng)性RA有效[4]，但其治療機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis， CIA）模型基礎(chǔ)上，探討四妙丸對(duì)高脂飼養(yǎng)CIA大鼠的血脂和關(guān)節(jié)影響，以揭示四妙丸治療RA的現(xiàn)代分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雌性，4～5周齡，體重（170±15）g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2009-0005。

1.2 試藥與儀器

牛Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑均購(gòu)于美國(guó)Chondrex公司，甲氨蝶呤由上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，四妙丸由吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1β和IL-17 ELISA試劑盒由北京達(dá)科為公司生產(chǎn)，總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒均購(gòu)于上海名典生物工程有限公司。半自動(dòng)生化分析儀由山東高密彩虹分析儀器有限公司提供，恒低溫離心機(jī)由美國(guó)Sigma公司提供。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 選取15只大鼠給予普通飼料作為正常對(duì)照組，另45只大鼠給予高脂飼料[5]（蔗糖∶豬油∶奶粉∶雞蛋∶普通飼料=30∶20∶4∶2∶63），建立CIA模型，大鼠共成模38只，隨機(jī)分為三組，其中模型組12只，四妙丸組13只，甲氨蝶呤組13只。

1.3.2 造模方法 按文獻(xiàn)[6]方法，將牛Ⅱ型膠原10 mg與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化，在無(wú)菌條件下，按每點(diǎn)皮下注射乳劑0.05 mL，初次免疫在大鼠背上任選3點(diǎn)，加強(qiáng)免疫于2周后同法二點(diǎn)注射。

1.3.3 灌胃給藥 初次免疫后第4周開(kāi)始每天1次灌胃治療，以體重計(jì)算，四妙丸為臨床人用劑量的10倍，每只大鼠按每100克體重灌胃1 mL，甲氨蝶呤按計(jì)量0.5 mg/kg灌胃給藥，同時(shí)正常對(duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃，各組均治療4周。

1.3.4 關(guān)節(jié)癥狀評(píng)分 采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分法評(píng)定[7]，評(píng)定依據(jù)為關(guān)節(jié)紅腫程度和范圍以及關(guān)節(jié)腫大和變形情況。0分：無(wú)紅腫；1分：趾關(guān)節(jié)稍紅腫，足爪或足墊單個(gè)區(qū)域炎癥；2分：關(guān)節(jié)輕度紅腫，足爪或足墊或踝關(guān)節(jié)兩個(gè)區(qū)域以上的炎癥；3分：關(guān)節(jié)中度紅腫，輕度功能障礙；4分：關(guān)節(jié)嚴(yán)重紅腫，僵直甚至畸形，嚴(yán)重功能障礙。

1.3.5 關(guān)節(jié)滑膜病理分析 初次免疫后第8周處死各組大鼠，取滑膜組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察組織形態(tài)變化。

1.3.6 血清血脂和細(xì)胞因子的檢測(cè) 初次免疫后第8周，處死各組大鼠前禁食12 h，腹主動(dòng)脈取血，分離血清檢測(cè)TG、TC、HDL-C和LDL-C水平，利用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-17的含量，按照說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)測(cè)試儀450 nm處讀數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

與正常對(duì)照組[（315.6±14.8）g]比較，模型組大鼠體重[（350.4±37.2）g]明顯增加（P < 0.05），而四妙丸組體重[（328.3±17.7）g]下降，較模型組和甲氨蝶呤組[（341.9±34.3）g]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。造模成功后關(guān)節(jié)炎大鼠第10天開(kāi)始逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，第2次免疫后關(guān)節(jié)炎癥狀持續(xù)加重，四妙丸組和甲氨蝶呤治療后關(guān)節(jié)炎癥狀較模型組明顯改善。

2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

隨著免疫時(shí)間延長(zhǎng)，正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分逐漸增加，四妙丸組和甲氨蝶呤組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分隨時(shí)間逐步下降，初次免疫41 d后與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

2.3 關(guān)節(jié)炎病理切片

正常對(duì)照組大鼠滑膜組織未見(jiàn)明顯的新生血管及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞呈單層規(guī)則排列。模型組大鼠的滑膜組織中光鏡下可見(jiàn)到淋巴組織浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞層次增多，可達(dá)十多層，排列紊亂，毛細(xì)血管增生明顯，血管翳形成，滑膜下層纖維組織增生，膠原纖維沉著，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及肉芽組織形成。四妙丸組和甲氨蝶呤組滑膜增生層次和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。見(jiàn)圖2。

2.4 各組血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C水平比較

模型組TG、TC及LDL-C水平較正常對(duì)照組明顯增加（P < 0.01），而HDL-C明顯下降（P < 0.01）（表1）。甲氨蝶呤組與模型組比較TG、TC、HDL-C及LDL-C差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；四妙丸組TC及LDL-C較模型組明顯下降（P < 0.01），而HDL-C則明顯升高（P < 0.01）；四妙丸組TC及LDL-C與甲氨蝶呤組比較明顯下降（P < 0.01），而HDL-C則明顯升高（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

表1 正常對(duì)照組與模型組大鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P < 0.01；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

表2 各治療組與模型組大鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

注：與模型組比較，*P < 0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲P < 0.01；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

2.5 各組血清中TNF-α、IL-1β和IL-17水平比較

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-17水平均明顯增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），見(jiàn)表3。與模型組比較，四妙丸組和甲氨蝶呤組各炎癥因子水平均明顯下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；四妙丸組與甲氨蝶呤組比較，TNF-α水平下降（P < 0.05），而IL-17水平則明顯升高（P < 0.05）。見(jiàn)表4。

表3 正常對(duì)照組與模型組大鼠血清炎癥因子水平比較（x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P < 0.01；TNF：腫瘤壞死因子；IL：白介素

表4 治療組與模型組大鼠血清中炎癥因子水平比較（x±s）

注：與模型組比較，*P < 0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲P < 0.05；TNF：腫瘤壞死因子；IL：白介素

3 討論

RA病程中由于滑膜的慢性炎癥和血管翳形成可侵蝕多個(gè)關(guān)節(jié)的骨和軟骨組織導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞功能喪失，CIA大鼠是目前公認(rèn)研究RA理想的動(dòng)物模型。RA滑膜細(xì)胞及滑膜組織中浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過(guò)作用于多種細(xì)胞并相互調(diào)節(jié)，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)了RA的發(fā)生和發(fā)展。在RA細(xì)胞因子相互作用網(wǎng)絡(luò)中，IL-1和TNF-α處于中心位置，二者均能促進(jìn)滑膜及軟骨細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和前列腺素E2而致關(guān)節(jié)破壞，局部的免疫復(fù)合物和游離膠原等又促使IL-1和TNF-α合成增加，加重炎癥損傷，其在RA發(fā)病中起著重要作用[8]。IL-17是一種強(qiáng)大的前炎癥細(xì)胞因子，也是炎性反應(yīng)的微調(diào)因子，由Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生，IL-17可通過(guò)上調(diào)軟骨細(xì)胞及滑膜成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1/3/13）的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)聚合素酶及膠原酶活性，促進(jìn)軟骨蛋白多糖和膠原降解，抑制軟骨細(xì)胞蛋白多糖的合成，并可增強(qiáng)單核細(xì)胞對(duì)軟骨基質(zhì)的破壞[9]。

最近有文獻(xiàn)報(bào)道，肥胖可能是RA發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因子，肥胖人群發(fā)病率的提高可能直接導(dǎo)致RA發(fā)病率的升高[10]。此外，肥胖會(huì)導(dǎo)致RA病情預(yù)后更差，一方面是心腦血管疾病的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增高，另一方面可能對(duì)抗風(fēng)濕病藥物（disease-modifying antirheumatic drugs， DMARDs）的治療反應(yīng)下降[11-13]。降血脂他汀類藥物常用于控制高膽固醇血癥、心血管疾病和炎癥患者的脂質(zhì)代謝紊亂，因?yàn)槠渚哂锌寡?、抗氧化劑、免疫調(diào)節(jié)和抗血栓作用。有臨床研究顯示，阿伐他汀具有改善RA患者關(guān)節(jié)炎癥狀的作用[14-15]。

四妙丸出自于清代張秉成《成方便讀》，由二妙丸加入牛膝、薏苡仁化栽而來(lái)。四妙丸中蒼術(shù)苦而溫，芳香而燥，直達(dá)中州，為燥濕健脾之主藥；黃柏為苦寒下降之品，入肝腎清下焦之濕熱；牛膝補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨，領(lǐng)蒼術(shù)、黃柏入下焦而祛濕熱也；薏苡仁獨(dú)入陽(yáng)明經(jīng)，祛濕熱而利筋絡(luò)。諸藥相合清流潔源，標(biāo)本兼顧，具有清熱利濕、宣痹通絡(luò)之功，使?jié)駸岬贸?，諸癥自愈[16]。

本研究通過(guò)建立高脂CIA大鼠做對(duì)照，同時(shí)設(shè)立正常大鼠進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飼料的CIA大鼠血清中血脂TC、TG和LDL-C水平較普通飼料大鼠均明顯增高（P < 0.01），而HDL-C明顯降低（P < 0.01）；與此同時(shí)，膠原免疫后關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯高于正常組，分別給予甲氨蝶呤和四妙丸治療后，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分明顯下降，免疫后41 d 與CIA模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；滑膜病理學(xué)積分證實(shí)給藥組的滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯下降；血清中血脂指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，四妙丸組大鼠TC和LDL-C水平明顯下降，而HDL-C水平明顯升高，與甲氨蝶呤組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；四妙丸組治療后血清中前炎癥因子TNF-α與甲氨蝶呤組治療后比較明顯下降（P < 0.05），但I(xiàn)L-17水平卻明顯高于甲氨蝶呤組（P < 0.05）。

四妙丸治療RA的機(jī)制可能是通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)的：①四妙丸中黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、牛膝均具有調(diào)節(jié)免疫抗炎鎮(zhèn)痛作用能阻斷炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的“瀑布效應(yīng)”，阻斷關(guān)節(jié)病變進(jìn)程。②高脂血癥和肥胖是RA的風(fēng)險(xiǎn)因子，二者均可加重RA病情，而四妙丸通過(guò)健脾祛濕的方法可明顯改善血脂異常，進(jìn)而改善RA的關(guān)節(jié)炎癥狀。③四妙丸與甲氨蝶呤相比，其針對(duì)改善炎癥因子TNF-α的作用更強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明了TNF-α可能是肥胖和關(guān)節(jié)炎的中軸性作用靶點(diǎn)，但多個(gè)免疫因子和免疫細(xì)胞參與了RA的發(fā)展，針對(duì)單一因子治療不能根本控制炎癥的發(fā)展和預(yù)后。

總之，本研究通過(guò)比較四妙丸和甲氨蝶呤治療高脂CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎及血清中炎癥因子的變化，發(fā)現(xiàn)二者均能改善CIA關(guān)節(jié)炎進(jìn)程，而四妙散兼具有改善血脂的作用，這將有助于對(duì)RA發(fā)生機(jī)制進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，同時(shí)為指導(dǎo)RA治療和預(yù)防提供了更加科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-11-06 本文編輯：程 銘）

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[9] 趙婷，郭亞春，高亞賢，等.薯茵皂昔元含藥血清對(duì)IL-17和TNF-α誘導(dǎo)大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364 NF-κB、AP-1的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（9）：2794-2797.

[10] Crowson CS，Therneau TM，Davis JM，et al. Contribution of obesity to the rise in incidence of rheumatoid arthritis [J]. Arthritis Care Res（Hoboken），2013，65（1）：71-77.

[11] Ajeganova S，Andersson ML，Hafstrm■I，et al. Association of obesity with worse disease severity in rheumatoid arthritis as well as with comorbidities： a long-term followup from disease onset [J]. Arthritis Care Res，2013，65（1）：78-87.

[12] Klaasen R，Wijbrandts CA，Gerlag DM，et al. Body mass index and clinical response to infliximab in rheumatoid arthritis [J]. Arthritis Rheum，2011，63（2）：359-364.

[13] Gremese E，Carletto A，Padovan M，et al. Obesity and reduction of the response rate to anti-tumor necrosis factor α in rheumatoid arthritis： an approach to a personalized medicine [J]. Arthritis Care Res，2013，65（1）：94-100.

[14] Mccarey DW，Mcinnes IB，Madhok R，et al. Trial of Atorvastatin in Rheumatoid Arthritis （TARA）： double-blind， randomised placebo-controlled trial [J]. Lancet，2004，363（9426）：2015-2021.

[15] 徐素粉，趙福濤，趙浩，等.FasL基因關(guān)節(jié)腔內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡的影響[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（3）：443-445.

[16] 王曉玉，張曉蘭，張麗，等.四妙丸對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（21）：2889-2892.

（收稿日期：2013-11-06 本文編輯：程 銘）

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[16] 王曉玉，張曉蘭，張麗，等.四妙丸對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（21）：2889-2892.

（收稿日期：2013-11-06 本文編輯：程 銘）