楊永青，謝遠(yuǎn)紅，張紅星，熊利霞，馬曉丹，劉慧*，孔保華

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京102206；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

枯草芽孢桿菌C3產(chǎn)抗菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化

楊永青1，2，謝遠(yuǎn)紅1，2，張紅星1，2，熊利霞1，2，馬曉丹1，2，劉慧1，2*，孔保華3

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京102206；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

利用篩選的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）C3研究提高產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件。通過(guò)測(cè)定枯草芽孢桿菌C3抗菌物質(zhì)對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率，設(shè)計(jì)6因素3水平正交試驗(yàn)得到優(yōu)化的發(fā)酵條件為：種子液的菌齡12h，種子液接種量2%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量75mL/250mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48h。在優(yōu)化發(fā)酵條件下，枯草芽孢桿菌C3產(chǎn)抗菌物質(zhì)的抑菌活性比優(yōu)化前提高了26.52%。

枯草芽孢桿菌；抗菌物質(zhì)；發(fā)酵條件優(yōu)化

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種公認(rèn)安全的有益微生物，對(duì)人畜無(wú)毒害，不污染環(huán)境，其在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中能產(chǎn)生包括肽類、脂肽類、多烯類、磷脂類、氨基酸類與核酸類等多種抗菌物質(zhì)，可以抑制霉菌、酵母菌、細(xì)菌、病毒等多種微生物的生長(zhǎng)，在果蔬保鮮、果實(shí)采后病害、植物病害的生物防治方面具有重要應(yīng)用價(jià)值[1-2]。張麗麗等[3]通過(guò)試驗(yàn)證明，枯草芽孢桿菌Sf-19培養(yǎng)原液對(duì)梨輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)的平板抑制率為87.33%，孢子萌發(fā)的抑制率為97%；黃曦等[4]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌ON-6菌株能抑制荔枝炭疽菌的生長(zhǎng)；李永剛等[5]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS2對(duì)葡萄灰霉病菌具有較好的拮抗作用；楊琦瑤等[6]報(bào)道枯草芽孢桿菌B006對(duì)黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌具有一定抑制作用?？莶菅挎邨U菌抗菌物質(zhì)具有較廣譜的抗菌作用，通過(guò)優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，提供最適的生長(zhǎng)環(huán)境，可以提高抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量與抑菌活性[7-9]。課題組前期試驗(yàn)優(yōu)化了枯草芽孢桿菌C3產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率提高了118.64%[10]。繼而課題組采用6因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件，以抑制率評(píng)價(jià)C3菌株抗菌物質(zhì)對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制活性，旨在提高C3菌株抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量，以便后續(xù)分離純化抗菌物質(zhì)，為進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)理及果蔬保鮮應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

指示菌株：黑曲霉（Aspergillus niger），由食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室保藏并提供。

試驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌C3，由食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室課題組篩選并保存，經(jīng)微量生化反應(yīng)與16s DNA方法鑒定為Bacillus subtilis。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸粉1.5%，KH2PO40.1%，NaCl 0.5%，MgSO4·7H2O 0.15%；pH 7.0，0.1MPa高壓滅菌15min。

種子液培養(yǎng)基[11]：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，NaCl1.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，pH 7.0。

指示菌斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[12]：馬鈴薯（去皮切塊）200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL，pH自然。

菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基內(nèi)加入0.1%吐溫-80，以及終質(zhì)量濃度為30.0μg/mL青霉素與鏈霉素混合液（青霉素與鏈霉素的質(zhì)量比為1∶1）[13]。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；THZ-C-1型臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；BS224S型電子天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；GHP-9160型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCN-1360B型無(wú)菌超凈工作臺(tái)：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；PHS-3B型雷磁便攜式酸度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 指示菌懸液制備

無(wú)菌超凈臺(tái)中將黑曲霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h后，用滅菌生理鹽水洗脫孢子，經(jīng)4層滅菌紗布過(guò)濾得黑曲霉孢子懸液。將黑曲霉孢子懸液按10倍梯度稀釋法制成10-2～10-6梯度黑曲霉孢子稀釋液，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗菌物質(zhì)粗提液制備

枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵液4℃10 000r/min離心15min，棄菌體取上清液，用0.22μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾即得到無(wú)菌抗菌物質(zhì)粗提液。

1.3.3 抗菌物質(zhì)活性的測(cè)定

抗菌活性的測(cè)定采用菌落計(jì)數(shù)法[14]。先吸取10-3～10-4濃度黑曲霉孢子稀釋液0.1mL加入菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板中，涂勻涂布，靜置10min，再取0.1mL抗菌物質(zhì)粗提液均勻涂布于上述培養(yǎng)基，靜置10min后，28℃培養(yǎng)24～48h，計(jì)數(shù)霉菌孢子萌發(fā)為菌落的數(shù)量，根據(jù)孢子萌發(fā)的數(shù)量評(píng)價(jià)抗菌物質(zhì)的活性。

霉菌孢子萌發(fā)抑制率的計(jì)算公式：

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)李凜等[16-19]的研究文獻(xiàn)及單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取種子液菌齡、接種量、裝液量、初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間6個(gè)影響因素，設(shè)計(jì)6因素3水平L18（36）正交試驗(yàn)，如表1所示。根據(jù)正交試驗(yàn)表分別進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至7.0，測(cè)定抗菌物質(zhì)活性。

表1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for fermentation condition optimization

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，選擇適宜的菌齡、接種量、裝液量、初始pH值、溫度及發(fā)酵時(shí)間組合為處理組，對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的效果進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)照組采用優(yōu)化前的發(fā)酵條件，按1.3.2方法測(cè)定抗菌物質(zhì)活性，同時(shí)計(jì)算霉菌孢子萌發(fā)抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

發(fā)酵條件對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量影響優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation condition optimization

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化的方差分析Table 3 Variance analysis of fermentation conditions optimization

2.1.1 種子液菌齡對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物大多在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或穩(wěn)定期合成，因此采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液進(jìn)行接種發(fā)酵，有助于縮短生長(zhǎng)曲線的遲緩期，并盡快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期?？莶菅挎邨U菌的抗菌物質(zhì)主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期、尚未進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)合成。陳雪等[20]研究細(xì)菌素的產(chǎn)量與枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期合成。由表2可知，采用不同菌齡的種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，枯草芽孢桿菌C3對(duì)黑曲霉的抑制活性影響表現(xiàn)為kA3＞kA1＞kA2，即接種發(fā)酵培養(yǎng)基的種子液菌齡為12h時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，6h次之，9h最小。由此表明種子液菌齡為12h時(shí)，正是菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間，故確定種子液的較優(yōu)菌齡為12h。由表3方差分析可知，采用不同菌齡的種子液接種發(fā)酵，對(duì)抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響極顯著（α=0.01）。

2.1.2 接種量對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

在一定范圍內(nèi)，較大的接種量更有利于微生物快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或穩(wěn)定期，但帶入培養(yǎng)基的代謝廢物亦增多，不利于微生物的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量。由表2可知，采用不同接種量時(shí)，枯草芽孢桿菌C3對(duì)黑曲霉的抑制活性表現(xiàn)為kB2＞kB3＞kB1，即接種量為2%時(shí)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量最高，接種量為3%時(shí)次之，接種量為1%最低。故確定種子液的較優(yōu)接種量為2%。由表3方差分析可知，不同種子液的接種量對(duì)抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響顯著（α=0.05）。

2.1.3 裝液量對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

枯草芽孢桿菌為好氧微生物，故充足的氧氣有利于其生長(zhǎng)代謝。裝液量的多少?zèng)Q定發(fā)酵時(shí)的通氣量。同時(shí)，充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于枯草芽孢桿菌的快速繁殖，增加產(chǎn)抗菌物質(zhì)的活菌基數(shù)。因此，在一定范圍內(nèi)調(diào)整裝液量比例，可提高枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的合成與積累。由表2可知，采用不同裝液量時(shí)，枯草芽孢桿菌C3對(duì)黑曲霉的抑制活性表現(xiàn)為kC3＞kC2＞kC1，即裝液量為75mL/250mL時(shí)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量最高，50mL/250mL時(shí)次之，25mL/250mL時(shí)最低。結(jié)果表明，裝液量為75mL/250mL時(shí)通氣量充足，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與通氣量二者對(duì)枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響達(dá)到最佳平衡點(diǎn)，此時(shí)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量最高。故確定發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為75mL/250mL。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量對(duì)抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響顯著（α=0.05）。

2.1.4 初始pH值對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

適當(dāng)?shù)某跏紁H值有利于微生物的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的積累。由表2可知，采用不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值時(shí)，枯草芽孢桿菌C3對(duì)黑曲霉的抑制活性表現(xiàn)為kD2＞kD1＞kD3，即初始pH值為7.0時(shí)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量最高，pH5.0時(shí)次之，pH9.0時(shí)最低。這與劉永峰等[21]優(yōu)化枯草芽孢桿菌B916產(chǎn)抗菌物質(zhì)發(fā)酵條件時(shí)的結(jié)果一致。故確定發(fā)酵培養(yǎng)基的較優(yōu)初始pH值為7.0。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響極顯著（α=0.01）。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的物理因素，適宜的發(fā)酵溫度有利于枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的合成與積累。由表2可知，采用不同發(fā)酵溫度時(shí)，枯草芽孢桿菌C3對(duì)黑曲霉的抑制活性為kE2＞kE1＞kE3，即37℃時(shí)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量最高，34℃時(shí)次之，40℃時(shí)最低。故確定37℃為較優(yōu)的發(fā)酵溫度。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵溫度對(duì)抗菌物質(zhì)的抑菌活性無(wú)顯著影響。

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

微生物代謝產(chǎn)物的積累是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，在不同發(fā)酵時(shí)間積累的代謝產(chǎn)物各不相同；同時(shí)，不同代謝產(chǎn)物出現(xiàn)的最大積累量的時(shí)間亦不同。在發(fā)酵過(guò)程的某一時(shí)刻，目的代謝產(chǎn)物會(huì)有最大的積累量。由表2可知，采用不同發(fā)酵時(shí)間時(shí)，枯草芽孢桿菌C3對(duì)黑曲霉的抑制活性表現(xiàn)為kF2＞kF1＞kF3，即發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量最高，24h時(shí)次之，72h時(shí)最低。故確定48h為較優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間。由表3方差分析可知，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)抗菌物質(zhì)的抑菌活性影響顯著（α=0.05）。

由表2中極差R值分析可知，以枯草芽孢桿菌拮抗霉菌孢子萌發(fā)生長(zhǎng)的黑曲霉菌落數(shù)為指標(biāo)，則RA（菌齡）＞RD（初始pH值）＞RC（裝液量）＞RF（時(shí)間）＞RB（接種量）＞RE（溫度），又由表3方差分析可知，菌齡、接種量、裝液量、初始pH值、時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)產(chǎn)量均有顯著影響（α=0.05），其中種子液菌齡和發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)產(chǎn)量有極顯著影響（α=0.01），即菌齡影響最顯著，其次是初始pH值、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、接種量，影響最小的是發(fā)酵溫度?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A3B2C3D2E2F2，即種子液菌齡12h，種子液接種量2%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量75mL/250mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48h。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)驗(yàn)證

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化前后的結(jié)果對(duì)比Table 4 Comparison of fermentation result before and after optimization

由表4可知，采用優(yōu)化組合條件對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，所產(chǎn)抗菌物質(zhì)可將黑曲霉孢子萌發(fā)數(shù)量由未優(yōu)化前的6.90×106CFU/mL降低至優(yōu)化后的5.07×106CFU/mL，對(duì)黑曲霉的抑制率提高了26.52%，抗菌活性明顯提高，表明采用優(yōu)化發(fā)酵條件可以較大增加枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

不同發(fā)酵條件對(duì)枯草芽孢桿菌C3抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量有明顯影響。其中種子液菌齡和發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)枯草芽孢桿菌C3抗菌物質(zhì)產(chǎn)量影響極顯著（α=0.01），接種量、裝液量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌C3抗菌物質(zhì)產(chǎn)量影響顯著（α=0.05），而發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌C3抗菌物質(zhì)產(chǎn)量無(wú)顯著影響。即影響枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的主次順序?yàn)椋悍N子液菌齡＞初始pH＞裝液量＞時(shí)間＞接種量＞溫度。

采用菌落計(jì)數(shù)法以抑制率評(píng)價(jià)C3菌株抗菌物質(zhì)對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制活性，通過(guò)正交試驗(yàn)得到優(yōu)化發(fā)酵條件為種子液的菌齡12h，種子液接種量2%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量75mL/250mL，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48h。在優(yōu)化發(fā)酵條件下，枯草芽孢桿菌C3產(chǎn)抗菌物質(zhì)的抑菌活性比優(yōu)化前提高了26.52%。

[1]張彩霞，李壯，康國(guó)棟，等.枯草芽孢桿菌防治果實(shí)采后病害的研究進(jìn)展[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2009，26（5）：699-703.

[2]楊潔.枯草芽孢桿菌E1R-j產(chǎn)抗菌脂肽的發(fā)酵條件優(yōu)化及分離純化[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士論文，2012.

[3]張麗麗，常有宏，丁芳兵，等.2株枯草芽孢桿菌對(duì)梨輪紋病菌的室內(nèi)抑制作用研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2010，27（5）：823-827.

[4]黃曦，張榮燦，王何健.枯草芽孢桿菌ON-6菌株抑制荔枝炭疽菌活性物質(zhì)的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（13）：188-193.

[5]李永剛，郭曉慧.枯草芽孢桿菌BS2對(duì)葡萄灰霉病菌抑菌機(jī)制的初步探索[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（5）：721-725.

[6]楊琦瑤，索雅麗，郭榮君.枯草芽孢桿菌B006對(duì)黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌組分分析[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2012，28（2）：235-242.

[7]孫亮，劉文波，楊廷雅，等.枯草芽孢桿菌HAB-1產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件[J].熱帶生物學(xué)報(bào)，2013，4（3）：225-230.

[8]南楠，戚向陽(yáng)，袁勇軍，等.枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（6）：77-83.

[9]陳瓊珍，吳興泉.枯草芽孢桿菌對(duì)有害真菌的生防作用及最佳發(fā)酵條件研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，32（5）：66-70.

[10]馬曉丹，張紅星，劉慧，等.枯草芽孢桿菌C3產(chǎn)抗菌物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2012，31（5）：10-14.

[11]高學(xué)文，姚仕義.枯草芽抱桿菌B2菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)分析[J].中國(guó)生物防治，2003，19（4）：175-179.

[12]高學(xué)文，姚仕義，HUONG P，等.枯草芽抱桿菌B2菌株產(chǎn)生的表面活性素變異體的純化和鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2003，43（5）：647-752.

[13]劉伊強(qiáng)，王雅平，潘乃糙.拮抗菌TG26的鑒定及其抗菌蛋白Bl的純化和部分特性[J].植物學(xué)報(bào)，1994，36（3）：97-203.

[14]劉慧.現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2006.

[15]李晶，楊謙，趙麗華，等.生防枯草芽孢桿菌B29菌株抗菌物質(zhì)的初步研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2008，28（2）：59-65.

[16]李凜，羅俊成，胡欣潔，等.類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的研究[J].釀酒科技，2005（4）：34-37.

[17]李占杰，李寶慶，鹿秀云，等.生防菌株CAB-1抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的條件及其穩(wěn)定性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（11）：5700-5702.

[18]石懷興，尚玉珂，季靜，等.培養(yǎng)條件對(duì)枯草芽孢桿菌G8抗菌蛋白含量的影響及蛋白液對(duì)黃瓜菌核病的生防效果[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（2）：244-249.

[19]劉林，黃云，劉勇.芽孢桿菌Bs2004菌株的鑒定、抑菌作用及發(fā)酵配方優(yōu)化研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2007.

[20]陳雪，侯紅漫，陳莉，等.產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌的篩選及發(fā)酵條件的研究[J].中國(guó)釀造，2008，27（9）：26-30.

[21]劉永鋒，陳志誼，周明國(guó).枯草芽孢桿菌Bs-916的抑菌活性及其抑菌物質(zhì)初探[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9（1）：92-95.

Optimization of fermentation conditions of antibacterial material production byBacillus subtilisC3

YANG Yongqing1,2,XIE Yuanhong1,2,ZHANG Hongxing1,2,XIONG Lixia1,2,MA Xiaodan1,2,LIU Hui1,2*,KONG Baohua3
(1.College of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China;2.Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing 102206,China;3.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The screenedBacillus subtilisC3 was used to study the fermentation conditions of antibacterial material production.By measuring antibacterial material ofB.subtilisC3 on the inhibition rate ofAspergillus nigerspore germination,an orthogonal experiment with 6 factors and 3 levels was conducted to optimize the fermentation condition.The optimum condition was follows:age of inoculums 12 h,inoculums 2%,fermentation medium with fluid volume 75 ml/250 ml,initial pH 7.0,temperature 37℃,fermentation time 48 h.Under the optimized condition,the activities of antibacterial material byB.subtilisC3 increased 26.52%comparing to the non-optimized one.

Bacillus subtilis;antibacterial material;fermentation condition optimization

Q93-335

A

0254-5071（2014）03-0028-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.008

2014-01-27

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B02-01）；“十二五”國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目子課題（2012AA101606-05）；北京市教育委員會(huì)面上項(xiàng)目（KM201410020010）

楊永青（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵。

*通訊作者：劉慧（1963-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)與功能性發(fā)酵食品。