陳 臣，李 艷，2，牟德華，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

香氣指標(biāo)是果酒感官質(zhì)量的重要組成部分，香氣成分的種類、含量、感官閾值及成分間的綜合作用決定著果酒的風(fēng)味和典型性[1]。對果酒香氣成分的研究，是評價其感官品質(zhì)、分析香氣特征的重要手段。

固相微萃取技術(shù)（Solid Phase M icroextraction，SPME）是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種樣品前處理技術(shù)，相對于傳統(tǒng)的液液萃取法，它以無需有機(jī)溶劑，分析樣品量少，操作簡單、快速，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣、解析于一體的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[2]。該法能最大程度的減少被測香氣成分的損失和變化，得到完整、真實的分析結(jié)果。頂空固相微萃取法是指在熱力學(xué)平衡的蒸汽相與被分析樣同時存在于一個密閉系統(tǒng)中，取上部氣體。Fedrizzi B等采用頂空固相微萃取方法萃取葡萄酒中3-巰基-1-己醇和3-巰基己基乙酸酯，來研究這兩種物質(zhì)在葡萄酒后熟過程中的變化及對葡萄酒風(fēng)味的影響[3]。Perestrelo R等在研究葡萄牙Terras Madeirenses紅酒香氣成分時，采用了頂空固相微萃取結(jié)合氣相質(zhì)譜的方法，檢測到酯類、醇類、酸類、萜烯類等60多種香氣物質(zhì)[4]。采用頂空固相微萃取法結(jié)合GC-FID檢測歐李果酒中的香氣成分目前未見報道。

本文通過響應(yīng)面分析法，對影響歐李發(fā)酵酒中香氣成分SPME萃取效果較大的3個主要因素進(jìn)行了優(yōu)化研究，包括：加鹽量、萃取溫度和萃取時間。并以優(yōu)化后的萃取條件結(jié)合GC-FID對歐李發(fā)酵酒香氣成分進(jìn)行了檢測分析，目的是客觀精確地測定歐李果酒中痕量的香氣成分，為改善和提高歐李果酒的風(fēng)味奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯乙醇（≥99.0%）、仲辛醇（≥99.0%） 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；己酸乙酯（≥99.0%） 天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；正丙醇（≥99.8%） 天津博迪化工有限公司；己醇（≥99.0%） 天津科密歐試劑開發(fā)中心；氯化鈉（≥99.5%）、無水乙醇（≥99.7%）、異丁醇（≥99.0%）、異戊醇（≥98.5%） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙酸異戊酯（≥99.0%）、丁二酸二乙酯（≥99.0%）、己酸（≥98.5%）、乳酸乙酯（≥99.0%） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；高純氮?dú)猓兌?9.999%） 石家莊市橋西西三教制氧站。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪華儀器廠；GC 7820A配有FID檢測器 美國安捷倫公司；2cm-50/30μm DVB/Carboxen/PDMS萃取頭、100μm PDMS萃取頭及萃取手柄 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 歐李酒釀造工藝流程 歐李果分選→手工破碎、去核→加SO2、果膠酶→調(diào)整成分→接種酵母菌→酒精發(fā)酵→壓榨、過濾取原酒→冷藏陳釀[5-6]→成分分析。

1.2.2 萃取條件單因素實驗 萃取頭優(yōu)選：DVB/ Carboxen/PDMS和PDMS兩種萃取頭在使用前分別按照說明書進(jìn)行老化。老化后的萃取頭分別以5m L歐李酒樣加到20m L頂空萃取瓶中，加入2g NaCl，在30℃下于磁力加熱攪拌器上平衡15m in，磁力攪拌轉(zhuǎn)速2000r/m in，將萃取頭插至萃取瓶液面上方，在30℃下萃取30m in，GC解吸3m in，以色譜峰面積和峰型來衡量萃取頭的萃取效果。

采用優(yōu)選的萃取頭，以5m L歐李酒樣加到20m L頂空萃取瓶中，磁力加熱攪拌器上平衡15m in，磁力攪拌轉(zhuǎn)速2000r/m in，GC解吸3m in為不變因素，分別改變加鹽量、萃取溫度和時間進(jìn)行單因素實驗。NaCl用量分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/m L時，固定萃取溫度30℃，萃取30m in。改變萃取溫度為25、30、35、40℃時，固定加鹽量為0.2g/m L，萃取30m in。在固定加鹽量為0.2g/m L，萃取溫度30℃時，分別萃取10、20、30、40、50m in。

1.2.3 萃取條件響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以加鹽量、萃取溫度和萃取時間為影響因素，被檢物質(zhì)出峰面積為響應(yīng)值[7-10]，運(yùn)用Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定HSSPME法萃取歐李發(fā)酵酒中香氣成分的最佳萃取條件。實驗設(shè)計中的水平及編碼表見表1。

1.2.4 GC-FID分析條件 Agilent 7820A GC-FID，色譜柱為HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為：氮?dú)?，流?m L/m in；升溫程序：50℃保持2m in，以5℃/m in升到240℃，保持10m in；檢測器（FID）：300℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；尾吹：25m L/m in；氫氣流量：40m L/min，空氣流量：400m L/min，不分流進(jìn)樣。

表1 Box-Behnken實驗因素水平及編碼Table1 The Box-Behnken experimental factors leveland coding

1.2.5 定性定量分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰的保留時間與樣品色譜峰的保留時間作對比進(jìn)行定性；以仲辛醇為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對各種香氣成分進(jìn)行定量[11-12]。

1.2.6 實驗方法的驗證和數(shù)據(jù)處理 實驗中對優(yōu)化的方法從回收率、線性范圍、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等進(jìn)行可行性的驗證[13]。實驗數(shù)據(jù)處理采用Design-expert 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行回歸分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的單因素實驗

2.1.1 萃取頭的選擇 萃取頭是固相微萃取技術(shù)的核心部分，其涂層材質(zhì)對所分析的物質(zhì)具有一定的選擇性。本實驗對DVB/Carboxen/PDMS和PDMS兩種萃取頭在相同實驗條件下進(jìn)行了優(yōu)選，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，萃取頭的涂層不同所吸附的香氣物質(zhì)含量不同。DVB/Carboxen/PDMS萃取頭比PDMS萃取頭萃取出的香氣物質(zhì)含量總出峰面積高336%，可見DVB/Carboxen/PDMS對歐李發(fā)酵酒香氣物質(zhì)的吸附比PDMS更有效，更適于歐李酒香氣組分得萃取。因此，以下的實驗過程中均使用DVB/Carboxen/PDMS萃取頭進(jìn)行萃取。

2.1.2 加鹽量的選擇 在萃取過程中加鹽可以提高離子強(qiáng)度，提高對目標(biāo)物的萃取效率[15]。由于鹽析作用，分析物的回收率提高，形成的水合球降低了可用于溶解分析物分子的水濃度，從而促使多余的分析物進(jìn)入纖維涂層中。然而，與這一過程競爭的另一過程是分析物分子可能會與溶液中的鹽離子發(fā)生靜電作用，這樣分析物進(jìn)入纖維涂層的能力就降低了[16]。NaCl加入量對歐李發(fā)酵酒香氣成分出峰面積的影響見圖2。

圖2 加鹽量對萃取效果的影響Fig.2 The influence on extraction effectby salt concentration

由圖2可見，加鹽后香氣物質(zhì)的萃取效果明顯增加，當(dāng)加鹽量為0.2g/m L時，出峰面積達(dá)到最大值。加鹽量超過0.4g/m L，萃取效果變差。因此，最佳加鹽量為0.2g/m L。

2.1.3 萃取溫度的選擇 萃取溫度升高可以增加離子動能，顯著縮短萃取時氣液兩項中物質(zhì)達(dá)到平衡的時間，使整個分析過程加快。但是升溫會帶來兩種截然相反的影響：從動力學(xué)角度看，SPME過程中溫度的升高可以加大分析物的擴(kuò)散系數(shù)，從而增加了分析物向涂層纖維的傳質(zhì)速率。而從熱力學(xué)角度考慮，由于萃取過程是放熱的，所以被萃取分析物的總量會隨著溫度的升高而降低[16-19]。從實踐角度考慮，選擇過高的萃取溫度，針尖和樣品之間的溫差會導(dǎo)致水的凝結(jié)，這種現(xiàn)象會降低方法的精密度，偶爾也會使FID的火焰熄滅[20]。萃取溫度對歐李發(fā)酵酒香氣成分出峰面積的影響見圖3。

圖3 溫度對萃取效果的影響Fig.3 The influence on extraction effectby temperature

從圖3可以看出，在選定的溫度范圍內(nèi)，隨萃取溫度升高，出峰面積呈先增加后減少的趨勢，30℃時出峰面積達(dá)到最大值，高于30℃，萃取效果明顯降低。因此，選擇30℃進(jìn)行萃取為宜。

2.1.4 萃取時間的選擇 萃取時間過長會使易揮發(fā)性物質(zhì)從纖維頭上脫附，而萃取時間過短，一些物質(zhì)尤其是高沸點(diǎn)的物質(zhì)又來不及被萃取頭吸附[21-22]。萃取時間對歐李發(fā)酵酒香氣成分出峰面積的影響見圖4。

圖4 萃取時間對萃取效果的影響Fig.4 The influence on extraction effectby time

從圖4可看出，在10～20m in，出峰面積隨萃取時間的延長而增加，萃取30min時峰面積達(dá)到最大值，在30～40m in，出峰面積有所降低，在40～50m in，出峰面積又有所回升，這是因為隨著萃取時間的延長，萃取頭所吸附的被檢物質(zhì)有脫落現(xiàn)象和再吸附的現(xiàn)象，因此，有效萃取時間以30min為宜。

2.2 萃取條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面法實驗設(shè)計及結(jié)果 響應(yīng)面法是利用合理的實驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[23]。響應(yīng)面法使得參數(shù)間的交互作用可通過有限次實驗進(jìn)行評估。響應(yīng)面法目前已成為降低成本、優(yōu)化加工條件的有效方法，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)等領(lǐng)域[24]。

本實驗在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用Design Expert 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行了實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析。根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，以加鹽量、萃取溫度、萃取時間為自變量，分別由A、B、C表示，以出峰面積為響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及結(jié)果Table2 The design and results of respond surface analysis

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗 利用Design Expert 7.0軟件對表2中實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多元回歸模型為：

對該模型的方差分析見表3。

由表3可知，模型p值0.0002，小于0.01，模型回歸極顯著；失擬項p值0.0969，大于0.05，失擬項不顯著，因此模型成立。C、AB、A2、B2、C2項p值均小于0.01，為極顯著；B和BC項p值均大于0.01而小于0.05，為顯著；A和AC項p值均大于0.05，為不顯著，說明線性項、二次項都有顯著影響，各個實驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，可以利用該回歸模型來分析和預(yù)測HS-SPME萃取歐李酒中香氣成分的最佳條件。其中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9672，校正復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.9250，說明模型可以解釋92.50%實驗所得色譜峰面積的變化，表明方程擬合較好。CV（Y的變異系數(shù)）表示實驗的精確度，CV值越高，實驗的可靠性越低，本實驗中CV=7.02%，較低，說明實驗操作可信?；貧w方程為色譜峰面積變化提供了一個合適的模型。

2.2.3 萃取條件對萃取效果的影響 加鹽量、萃取溫度和萃取時間對被檢物質(zhì)出峰面積交互作用的響應(yīng)曲面圖見圖5。

圖5 響應(yīng)面立體圖Fig.5 The response surface stereogram

表3 回歸模型方差分析Table3 ANOVA for response surface quadraticmodel

由圖5（A）可知，隨著萃取溫度的升高，出峰面積呈迅速增加后減少的趨勢；而隨著加鹽量的增加，出峰面積也呈迅速增加后略有減少趨勢[18]。由圖5（B）可知，隨萃取時間延長，出峰面積呈迅速增加的趨勢；而隨加鹽量的增加，出峰面積呈增加又減少的趨勢。由圖5（C）可知，隨萃取溫度升高，出峰面積呈先增加后減少的趨勢；相對于萃取溫度，萃取時間對出峰面積的影響較大，隨著萃取時間的延長，出峰面積增加迅速。結(jié)合表3和圖5可見，AB即加鹽量和萃取溫度的交互作用，對出峰面積的影響最大，為影響極顯著的因素。

2.2.4 萃取條件的優(yōu)化及驗證實驗 對顯著因素水平的優(yōu)化運(yùn)用Design Expert 7.0軟件對回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋求最大出峰面積穩(wěn)定點(diǎn)及對應(yīng)的因素水平，結(jié)合回歸方程的三維響應(yīng)面圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，即最大值。當(dāng)因素A、B、C取值分別為0.226g/m L、28.590℃、35.630min時，響應(yīng)值Y達(dá)到最大值1.7384E+008，即出峰面積最大?？紤]到實際應(yīng)用過程中的可操作性，A、B、C的取值分別為：加鹽量0.226g/m L、萃取溫度29℃、萃取時間36m in。經(jīng)驗證實驗證實，實際出峰面積為17186870，是預(yù)測值的98.87%，說明該模型可較好地反映歐李發(fā)酵酒香氣物質(zhì)檢測時，頂空固相微萃取的條件[25-26]。

2.2.5 HS-SPME萃取歐李酒香氣的氣相色譜分析

圖6 歐李酒樣通過50/30μm DVB/Carboxen/PDMS萃取氣相色譜圖Fig.6 Chromatogram of a fruitwine extractobtained from Prunus humilis Bungewine by 50/30μm DVB/Carboxen/PDMS

以響應(yīng)面法確定出的最優(yōu)萃取條件對歐李發(fā)酵酒香氣成分進(jìn)行萃取，即取5m L歐李酒樣加到20m L頂空萃取瓶中，加入0.226g/m L NaCl，在29℃下于磁力加熱攪拌器上平衡15m in，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為2000r/m in，將DVB/Carboxen/PDMS萃取頭插至液面上方，萃取36m in，GC解吸3m in。結(jié)合GC-FID分析，得到氣相色譜圖，共檢測出32種香氣物質(zhì)。通過香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品保留時間與歐李發(fā)酵酒中香氣成分的對比，對酒樣中10種主要香氣成分進(jìn)行定性；用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，檢測時，向9個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中均加入200μL仲辛醇為內(nèi)標(biāo)物（0.19848g/L），以待測組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測組分的濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，酒樣檢測時也加入相同量的內(nèi)標(biāo)物，然后用回歸方程計算出各香氣成分的含量，歐李發(fā)酵酒色譜分析圖見圖6，所定量的10種香氣物質(zhì)及含量分別為：異戊醇110.734mg/L、異丁醇8.7725mg/L、苯乙醇47.178mg/L、丙醇1.7032mg/L、己醇1.0042mg/L、己酸乙酯11.568mg/L、乙酸異戊酯15.655mg/L、乳酸乙酯1.7847mg/L、丁二酸二乙酯5.3988mg/L、己酸10.862mg/L，這10種物質(zhì)的總量占測得32種香氣物質(zhì)含量的78.08%，其中異戊醇、苯乙醇含量較高。

2.3 固相微萃取方法的有效性驗證

本研究考察了優(yōu)化后的萃取方法分析歐李果酒中香氣物質(zhì)的可行性，包括方法的線性范圍、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析結(jié)果見表4。

表4中，已定性出的10種物質(zhì)線性范圍為0.1～1mg/L至20～100mg/L，線性相關(guān)系數(shù)0.9863～0.9998。回收率的測定是在歐李酒中加入10種物質(zhì)的混標(biāo)溶液，10種物質(zhì)的加入量分別為：異戊醇60.12mg/L、己酸乙酯24.60mg/L、異丁醇5.71mg/L、苯乙醇50.18mg/L、乙酸異戊酯7.16mg/L、丙醇3.04mg/L、乳酸乙酯3.44mg/L、丁二酸二乙酯9.07mg/L、己酸5.21mg/L、己醇2.10mg/L，按照加標(biāo)回收率的計算方法得出回收率為80.48%～100.81%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是3次重復(fù)測定后的結(jié)果，為3.24%～9.76%。

3 結(jié)論

本文對利用GC-FID檢測歐李發(fā)酵酒時HSSPME方法進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，優(yōu)化后的萃取條件為：加鹽量0.226g/m L、萃取溫度29℃、萃取時間36min。在優(yōu)化條件下的驗證實驗，得到出峰面積實測值為17186870，是預(yù)測值的98.87%，說明響應(yīng)面分析所得優(yōu)化模型是可靠的。從線性范圍、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等對檢測方法的可行性驗證，可知該方法是一種快速、準(zhǔn)確的分析方法[27]。

表4 頂空固相微萃取對歐李酒樣品香氣成分GC-FID分析結(jié)果（n=3）Table4 The analysis results of aroma components in Prunus humilis Bunge wine by HS-SPME combined with GC-FID（n=3）

以優(yōu)化所得HS-SPME條件，結(jié)合GC-FID檢測出歐李發(fā)酵酒中32種香氣物質(zhì)，對其中10種進(jìn)行了定性和定量分析，分別為異戊醇110.734mg/L、異丁醇8.7725mg/L、苯乙醇47.178mg/L、丙醇1.7032mg/L、己醇1.0042mg/L、己酸乙酯11.568mg/L、乙酸異戊酯15.655mg/L、乳酸乙酯1.7847mg/L、丁二酸二乙酯5.3988mg/L、己酸10.862mg/L，這10種物質(zhì)的總量占測得32種香氣物質(zhì)含量的78.08%，其中異戊醇、苯乙醇含量較高，體現(xiàn)了歐李發(fā)酵酒獨(dú)特的風(fēng)味[28]。

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