賀曉玉，羅 杰，李英倫

(四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川雅安625014)

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的迅速發(fā)展，中藥渣廢棄量日益增加。這些藥渣被視為廢物，采取堆放、填埋、焚燒等方式處理，不僅資金投入大，污染環(huán)境，更是一種極大的資源浪費［1］;更為嚴重的是，部分中藥藥渣再次進入藥材市場，以次充好，真?zhèn)坞y辨，損害藥品生產企業(yè)以及消費者的利益。中藥主要有植物、動物以及部分礦物藥，其中植物類藥材占87%以上。植物類中藥渣中含有大量粗纖維、粗蛋白、粗脂肪、糖類、氨基酸等營養(yǎng)物質，以及鈣、鎂、鐵、磷等多種無機元素［2］;而且由于中藥提取工藝比較單一，許多藥用活性成分仍殘留在藥渣中［3］。據(jù)報道，中藥制藥過程中有效成分的提取率一般為30%～70%，大量活性成分仍殘留在藥渣中［4］。

目前，有關中藥渣綜合利用技術的研究很多，例如作為食用菌(平菇，香菇等)的培養(yǎng)基［5-6］、栽培蔬菜［7］、制造絮凝劑或吸附劑處理廢水［8］、用作動物飼料添加劑［9-11］，發(fā)酵生產乙醇［12］等，但大多屬于探索性研究，真正能夠投入實際應用的技術不多，能夠大規(guī)模的消化中藥渣，變廢為寶，減輕環(huán)境壓力的技術更少。

鑒于此，本實驗采用藥用真菌雙向固體發(fā)酵技術［13］，以蛹蟲草菌為發(fā)酵菌種，發(fā)酵五味子藥渣，并采用響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件，旨在尋求一條綜合利用五味子藥渣的有效途徑，為中藥渣的回收再利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草菌［Cordycepsmilitaris(L.)Link］ 山東省東方蟲草科技園提供，并經中國科學院微生物研究所鑒定;五味子藥渣 雅安三九藥業(yè)有限公司提供;蟲草素標準品(批號:MUST-11072701) 四川省藥品檢驗所，含量≥98%;甲醇 北京京科瑞達生物科技有限公司，色譜純;葡萄糖、重蒸酚、濃硫酸 國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠;SPX型生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司; LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SHB-3循環(huán)多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠; HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司; UV-2000型紫外可見分光光度計 優(yōu)尼柯上海儀器有限公司;高效液相色譜儀(LC-2010C HT) SHIMADZU CORPORATION;pHS-25型酸度計 成都方舟科技開發(fā)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥渣處理 將五味子藥渣置于烘箱中，50℃烘干至恒重，粉碎過20目篩，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 菌種活化培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯20%(煮后過濾取汁)，葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，瓊脂2%，蒸餾水1000m L，pH自然［14］。液體菌種培養(yǎng)基:葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，蒸餾水1000m L，pH自然［15］。

1.2.3 菌種活化 在超凈工作臺上按無菌操作，將蛹蟲草菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中25℃避光培養(yǎng)6d，制成活化菌種［16］。

1.2.4 種子液制備 在裝有200m L液體種子培養(yǎng)基的500m L三角瓶中，放入6粒直徑為3～6mm的玻璃珠，按照無菌操作，接入大小約為5mm×5mm的經活化后的蛹蟲草斜面菌塊，25℃，120r/min振蕩避光培養(yǎng)6d，制成種子液［17］。

1.2.5 單因素實驗確定因素水平范圍 將發(fā)酵基礎條件定為:水料比［蒸餾水體積(m L):五味子藥渣重量(g)］為2m L/g、基質(五味子藥渣)重量為40g、接種量［種子液體積(m L):五味子藥渣重量(g)］為10%、發(fā)酵溫度為25℃、發(fā)酵時間為9d［18］。在此基礎條件下，分別考察各因素的變化對發(fā)酵產物中蟲草素和多糖含量的影響。按照以下因素水平設計實驗:水料比:0.5、1、1.5、2、2.5、3m L/g;基質重量:10、20、30、40、50、60g;接種量:5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%;發(fā)酵溫度:20、22、24、26、28、30℃;發(fā)酵時間:5、7、9、11、13、15、17、19d。上述各處理組均用蟲草瓶盛裝培養(yǎng)基，并按照無菌操作方法，接種蛹蟲草菌種子液后，置于生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。發(fā)酵終止后將各組發(fā)酵產物(整個培養(yǎng)基質)置于烘箱中，50℃下烘干至恒重，粉碎，并充分混勻，用于檢測蟲草素及多糖含量。

1.2.6 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件 在單因素實驗的基礎上，采用Box-Benhnken(BBD)實驗設計，以水料比(A)、基質重量(B)、接種量(C)、發(fā)酵溫度(D)4個顯著性因素為考察變量，以發(fā)酵產物中蟲草素含量為響應值(Y)，進行4因素3水平實驗，實驗因素及水平見表1。并應用Design-expert V8.0.5b軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立數(shù)學回歸模型確定最佳發(fā)酵條件。

表1 Box-Benhnken實驗設計因素及水平Table1 Factor-levels for Box-Benhnken

1.2.7 蟲草素及多糖含量測定 多糖含量測定:稱取5g經烘干后的發(fā)酵產物樣品，采用水熱回流提取法提取多糖，即加10倍量水，80℃熱回流提取1.5h，重復3次。合并提取液，過濾、濃縮至1∶1(g/m L)，加3倍量的分析純乙醇沉淀，離心，傾出上清液，再用乙醇洗沉淀2次，離心，低溫干燥，即得多糖粗品［19］。采用濃硫酸-苯酚法［20］測定多糖含量，以分析純葡萄糖為多糖標準品繪制標準曲線，得回歸方程Y= 0.0078X-0.061(R2=0.9992)，根據(jù)該方程計算發(fā)酵產物中多糖含量。

蟲草素含量測定:稱取2.5g經烘干后的發(fā)酵產物樣品，加入90%甲醇50m L，70℃ 回流提取40m in后，過濾取濾液，再加入90%甲醇定容至50m L。采用高效液相色譜法(HPLC)測定蟲草素含量，色譜條件為:Diamonsil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，以磷酸鹽緩沖液(pH6.5)(取0.01mol/L磷酸二氫鈉68.5m L與0.01mol/L磷酸氫二鈉31.5m L，混合)-甲醇(17∶3)為流動相，流速為1m L/m in，檢測波長為260nm，進樣量為10μL，柱溫為30℃［21-22］。以蟲草素標準品繪制標準曲線，得回歸方程Y=34473X+34135(R2=0.9988)，根據(jù)該方程計算發(fā)酵產物中蟲草素含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 本實驗數(shù)據(jù)均為5個平行樣的平均值，采用 Excel 2003及 Design Expert V8.0.5b數(shù)據(jù)分析軟件分析。

2 結果及分析

2.1 單因素實驗結果及分析

由圖1a～圖1e可以看出，水料比、基質重量、接種量、發(fā)酵溫度4個因素對蛹蟲草菌固體發(fā)酵五味子藥渣產物中蟲草素含量的影響較大(成倍增減);而各因素對發(fā)酵產物中多糖含量的影響相對較小(變化不大)，這是由于蛹蟲草菌在生長過程中一方面要分解利用培養(yǎng)基中多糖，另一方面又代謝產生多糖的緣故，進而發(fā)酵基質中多糖含量比較穩(wěn)定。

由圖1a可知，水料比對蟲草素含量的影響很大，當水料比為1.5m L/g時，發(fā)酵產物中蟲草素含量最高。水料比在0.5～1.5m L/g范圍內，發(fā)酵產物中蟲草素含量迅速增加;當水料比高于1.5m L/g時，蟲草素含量顯著降低，可能是由于過高的含水量導致培養(yǎng)基黏度增加，多孔性降低，減少了培養(yǎng)基質內氣體的交換，造成局部缺氧，不利于蛹蟲草菌對中藥渣的降解利用。

圖1 各因素對發(fā)酵產物中蟲草素及多糖含量的影響Fig.1 Effects of various factors on the production of cordycepin and polysaccharide

由圖1b可知，當基質重量為30g時，發(fā)酵產物中蟲草素含量最高。當基質重量低于30g時，蟲草素含量降低，原因在于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質較少，不能滿足蛹蟲草菌的生長需要;當基質重量高于30g時，蟲草素含量顯著降低，究其原因可能是培養(yǎng)基厚度增加，導致培養(yǎng)基底層缺氧，蛹蟲草菌不能滲入培養(yǎng)基底部生長。

由圖1c可知，當接種量為20%時，發(fā)酵產物中蟲草素含量最高。接種量在5%～20%范圍內，蟲草素含量隨著接種量的增加而增多，上升趨勢明顯。當接種量超過20%時，蟲草素含量明顯下降，原因在于菌量較多時，對營養(yǎng)物質的需求也多，而培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質有限，當生長到一定程度后就不能繼續(xù)滿足微生物的正常生長了，同時由于接種量增多，過早進入衰亡期，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，使菌株的正常生長繁殖受到抑制。

由圖1d可知，當培養(yǎng)溫度為24℃時，發(fā)酵產物中蟲草素含量最高。溫度影響酶的活性，從而影響蛹蟲草菌對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的分解利用。溫度太高或者太低，都不利于蛹蟲草菌生長繁殖。

由圖1e可知，當發(fā)酵時間為15d時，發(fā)酵產物中蟲草素含量最高。之后，蟲草素含量幾乎不變，原因在于隨著發(fā)酵時間的延續(xù)，培養(yǎng)基質中營養(yǎng)物質越來越少，以致不能維持蛹蟲草菌生長，因此發(fā)酵時間定為15d。

2.2 響應面法確定最佳發(fā)酵條件

2.2.1 響應面實驗設計及結果 根據(jù)Box-Benhnken實驗設計原理，結合上述單因素實驗結果，將發(fā)酵時間固定為15d，選取水料比(A)、基質重量(B)、接種量(C)、培養(yǎng)溫度(D)四個顯著因素為考察變量，以發(fā)酵產物中蟲草素含量(Y)為響應值，進行四因素三水平實驗設計，實驗設計方案及結果見表2。

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗 利用 Design Expert V8.0.5b軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程為Y=4.76+0.89A+0.32B+0.31C+0.13D+0.23AB-0.09AC+0.42AD+0.26BC+0.24BD +0.091CD-1.05A2-0.70B2-0.37C2-0.43D2(R2= 0.9799，Ad j-R2=0.9598)?；貧w方程的方差分析結果見表3。由表3可知，模型(p＜0.0001)極顯著，相關系數(shù)R2=0.9799，說明該模型擬合度好，實驗誤差小;失擬項(p=0.372＞0.05)不顯著，表明未知因素對實驗結果干擾小。因此，可用此模型來分析和預測蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣的發(fā)酵條件。

2.2.3 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣最佳發(fā)酵條件的預測及驗證實驗 通過回歸模型預測分析，在實驗的因素水平范圍內，最佳發(fā)酵條件:水料比為2m L/g、基質重量為36.68g、接種量為23.15%、發(fā)酵溫度為25.78℃，模型預測發(fā)酵產物中蟲草素含量為5.0962mg/g?？紤]到實驗操作的可行性，將此最佳發(fā)酵條件稍作修改:水料比為2m L/g、基質重量為37g、接種量為23%、培養(yǎng)溫度為26℃。在此條件下進行重復驗證實驗，10個重復驗證實驗所得發(fā)酵產物中蟲草素含量平均值為5.1202mg/g，與模型預測值相差0.47%?？梢?，模型預測值和實測值之間具有良好的擬合性，從而響應面法優(yōu)化的發(fā)酵條件可為今后蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣生產和開發(fā)利用提供必要的理論依據(jù)。

3 結論與討論

3.1 由于實驗條件限制，本實驗僅考察了水料比、基質重量、接種量、發(fā)酵溫度四個主要因素對蛹蟲草菌固體發(fā)酵五味子藥渣的影響。各因素對發(fā)酵產物中蟲草素含量的影響均較大，響應面法優(yōu)化得出最佳發(fā)酵條件為:水料比2m L/g，基質重量37g，接種量23%，發(fā)酵溫度26℃。在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵所得產物中蟲草素含量為5.1202mg/g。這是因為蛹蟲草菌在生長代謝過程中產生多種酶，如纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等，可分解利用五味子藥渣中大分子營養(yǎng)物質［23］生長繁殖，進而產生蟲草素。經測定，發(fā)酵前五味子藥渣中多糖含量為22.95mg/g，而發(fā)酵產物中多糖含量為28.68mg/g，比發(fā)酵前的五味子藥渣高24.97%，這可能是蛹蟲草菌產生了蟲草多糖，或是五味子藥渣經蛹蟲草菌產生的各種分解酶作用后，殘留其中的多糖溶出，亦或是二者相加的結果。

表2 Box-Benhnken實驗設計方案及結果Table2 Results of four factors，Box-Benhnken experimental design

3.2 五味子中含有木脂素、多糖、揮發(fā)油等多種活性成分，但目前對五味子的利用主要集中在木脂素，其他藥用活性成分仍部分殘留在藥渣中。蛹蟲草菌產生的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等，可使五味子藥材細胞破裂，促使活性成分更多的溶出，而大部分這類物質是不被蛹蟲草菌生長所利用的，如五味子木脂素等，這些物質便在發(fā)酵基質中富集［24］。本實驗僅研究了發(fā)酵前后培養(yǎng)基質中蟲草素和多糖的含量變化，五味子有效活性成分，如木脂素等的含量變化有待進一步研究。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance(ANOVA) for the quadratic polynomialmodel

3.3 蟲草素具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等廣泛的生物學活性［25］，而多糖亦是一種作用廣泛的免疫促進物質。因此，發(fā)酵產物有望用于動物保健藥或治療藥物的開發(fā)、提取分離蟲草素等，具有廣闊的應用前景。將五味子藥渣用作蛹蟲草菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基，提高了五味子藥渣的利用價值，為中藥渣的回收再利用提供了參考。

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