瞿桂香，展躍平，施帥，蒲麗麗，王正云

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州225300）

堿性蛋白酶酶解蘇姜豬骨的工藝研究

瞿桂香，展躍平，施帥，蒲麗麗，王正云

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州225300）

研究了堿性蛋白酶酶解蘇江豬骨的工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶活力、酶解溫度、酶解時間、pH為因素，以水解度為指標，采用正交試驗對酶解工藝參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)酶解條件為骨粉溶液質(zhì)量分數(shù)10%，酶活力5 000 U，酶解溫度50℃，酶解時間4.5 h，pH 8.0，在此條件下，水解度為24.31%。

酶解；蘇姜豬骨；水解度

豬骨營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)廉價的天然資源。它與牛肉粉、雞蛋粉相比，具有高蛋白、低脂肪、高灰分的特點[1]；豬骨含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸，且氨基酸比例均衡，其中必需氨基酸含量同比高于牛乳、豬肉，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白[2]。它還含有豐富的呈味物質(zhì)，主要為呈味氨基酸、肽類、核苷酸、有機酸、含氮有機物等，以含氮物質(zhì)為主[3]。骨骼中鈣磷含量高，鈣和磷的比值近似2∶1，是人體吸收鈣磷的最佳比例[4]，此外，還含有豐富的礦物質(zhì)元素和維生素等成分。蘇姜豬是在地方品種姜曲海豬基礎(chǔ)上，引入國外豬種經(jīng)雜交育種而成，是蘇中地區(qū)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的特色之一，在蘇姜豬產(chǎn)品的開發(fā)過程中，對豬骨中的蛋白及其他營養(yǎng)成分并未充分利用，每年都有大量的豬骨被白白浪費，并且造成環(huán)境污染[5]。

酶解是一條優(yōu)化利用豬骨蛋白的途徑，可將一般加工溫度和短時間加熱難以利用的骨膠原蛋白水解成多肽及L-氨基酸，可大大提高其營養(yǎng)價值和功能特性[6]，從而變廢為寶，為企業(yè)減少經(jīng)濟損失、提高經(jīng)濟效益。因此，運用酶解回收利用骨蛋白極具研究意義和價值。目前有關(guān)畜骨的酶解利用日益受到人們的重視。酶的選擇、酶解條件控制及苦味的脫除等方面的研究也越來越多[7]，王朝旭等[8]比較了胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對骨粉的水解效果；李帆等[9]用中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牦牛骨蛋白以制得多肽；趙勝年等[10]用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解牛骨；解蕊等[11]用木瓜蛋白酶水解雞骨泥等。

本研究以蘇姜豬骨為底物，以水解度為主要指標，研究了堿性蛋白酶水解豬骨蛋白的最佳酶解條件，為相關(guān)豬骨蛋白產(chǎn)品開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬尾骨：江蘇牧院蘇姜豬肉專賣店；堿性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司（酶活力50 000 U/g）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204B分析天平：上海精科有限公司；HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東光學儀器廠；YXQ-SG46-280S型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；FW-80型高速萬能粉碎機：東莞創(chuàng)瑞工業(yè)設(shè)備有限公司；pHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 操作流程

原料預處理→骨粉（110目過篩，通過率95%，備用）→酶解→滅酶→過濾。

1.3.2操作要點

（1）原料預處理：將冷藏新鮮蘇姜豬尾骨去除不宜加工的部分，并用50℃的溫水清洗三遍，倒去污水。121℃高溫蒸汽滅菌鍋中蒸45 min。為了方便將骨頭放到粉碎機中粉碎，將小段骨頭再次砍截至每段長度＜1 cm。將經(jīng)過二次砍截的骨頭塊放入粉碎機中粉碎至泥狀，使骨粉手感細膩，無顆粒感，氣味清香[12]。

（2）酶解：采用堿性蛋白酶在一定條件下（加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH值）下進行酶解，使豬骨蛋白降解。

（3）滅酶：將酶解后的溶液于85℃水浴中滅酶10 min，使蛋白酶失活。

（4）離心過濾：將酶解溶液離心，取上清液，測定水解度。1.3.3單因素試驗設(shè)計

（1）酶活力對水解度的影響：100 mL質(zhì)量分數(shù)10%骨粉溶液、溫度50℃、酶解時間4 h、pH8.0，酶活力分別為3000U、4 000 U、5 000 U、6 000 U、7 000 U的條件下，在恒溫水浴鍋中水解，在85℃水浴中滅酶，測水解度。

（2）酶解溫度對水解度的影響：100 mL質(zhì)量分數(shù)10%骨粉溶液、酶活力為5 000 U、酶解時間4 h、pH8.0，溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的條件下，在恒溫水浴鍋中水解，在85℃水浴中滅酶，測水解度。

（3）酶解時間對水解度的影響：100 mL質(zhì)量分數(shù)10%骨粉溶液、酶活力為5 000 U、溫度50℃、pH8.0，酶解時間分別為3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h的條件下，在恒溫水浴鍋中水解，在85℃水浴中滅酶，測水解度。

（4）酶解pH對水解度的影響：100 mL質(zhì)量分數(shù)10%骨粉溶液、酶活力為5 000 U、溫度50℃、酶解時間4 h，分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的條件下，在恒溫水浴鍋中水解，在85℃水浴中滅酶，測水解度。

1.3.4 酶解工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行4因素3水平L9（34）正交試驗[13]，在恒溫水浴鍋中進行水解，然后在85℃滅酶使酶失去活性，測水解度。

表1 豬骨酶解工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for porcine bone hydrolysis technology optimization

1.3.5 測定方法

水解度是衡量蛋白質(zhì)水解的重要指標之一，水解度越大，表明蛋白質(zhì)水解越徹底，游離氨基酸的含量越高。測定方法選擇甲醛滴定法[14]。水解度計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力對水解結(jié)果的影響

圖1 酶活力對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme activity on hydrolysis degree

從圖1可知，酶活力對豬骨蛋白水解效果有顯著的影響。隨著酶活力的增加，水解度逐漸升高。因為當?shù)孜餄舛扰c反應時間一定時，底物的水解度取決于酶活力，只有當酶分子在體系中趨于飽和后，部分酶分子不能和底物接觸時，水解度的提高才會減慢甚至停止[15]。但從圖1中可發(fā)現(xiàn)，當酶活力達到一定值時，隨酶活力的增加，水解度的升高趨于緩慢。由于水解底物是有限的，當酶活力達到一定程度時，就可將大部分的底物反應掉。由于水解底物的缺乏，這時即使酶活力再增加，也無法使水解度得到顯著提高。堿性蛋白酶水解豬骨蛋白時，酶活力在5 000 U，水解度上升速度已非常緩慢，因此，確定堿性蛋白酶水解豬骨蛋白的最適酶活力為4 000～6 000 U。

2.2 酶解溫度對水解度的影響

圖2 酶解溫度對水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis degree

由圖2可知，溫度對水解效果的影響較顯著。酶是特定的蛋白質(zhì)，只有在特定溫度下，酶才能保持其最佳的活性。堿性蛋白酶水解豬骨蛋白時，溫度40～50℃之間，水解度逐漸升高；而當溫度50～60℃，水解度逐漸下降，溫度為50℃時水解度達到最高。因此，確定堿性蛋白酶水解豬骨蛋白的最適溫度范圍為45～55℃。

2.3 酶解時間對水解度的影響

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of time on hydrolysis degree

由圖3可知，水解時間對水解效果有一定影響。水解豬骨蛋白時，隨水解時間的延長，水解度逐漸升高，但當水解一定時間后，水解度的升高趨于緩慢。這是因為隨著水解的進行，蛋白質(zhì)底物逐漸減少，且酶解產(chǎn)物不斷積累對酶本身造成抑制。堿性蛋白酶水解豬骨蛋白4.0 h以后，水解度曲線逐漸趨于平坦，因此，選擇堿性蛋白酶水解豬骨蛋白的最適時間是3.5～4.5 h。

圖4 酶解pH對水解度的影響Fig.4 Effect of pH on hydrolysis degree

2.4 酶解pH對水解度的影響

由圖4看出，pH值對水解效果的影響較顯著。在近中性的條件下，水解度較低；隨著pH值的升高，水解度出現(xiàn)最大值；當pH值再逐漸增大，水解度則隨之降低。主要原因是酶的作用條件需要最適的pH值環(huán)境，超出最適pH值范圍都會使酶的活性下降，酶解效果降低，從而使水解度下降。堿性蛋白酶水解豬骨蛋白pH值達到8.0后，水解度曲線逐漸趨于平坦并有下降趨勢，因此，選擇堿性蛋白酶水解豬骨蛋白的最適pH7.5～8.5。

2.5 最佳酶解條件的優(yōu)化

在100mL質(zhì)量分數(shù)10%骨粉溶液的條件下，采用L9（34）正交試驗，以水解度為評價指標，確定堿性蛋白酶酶解豬骨蛋白的最佳酶解條件，結(jié)果見表2。

表2 堿性蛋白酶酶解豬骨蛋白工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal test for porcine bone hydrolysis technology optimization by alkaline protease

由表2可知，極差的大小順序為A＞D＞B＞C。極差越大則對結(jié)果的影響越大，因此，影響因素主次順序為A＞D＞B＞C，即酶活力＞pH值＞溫度＞水解時間。根據(jù)正交試驗的結(jié)果可以看出，在100 mL質(zhì)量濃度10%的骨粉溶液環(huán)境中，堿性蛋白酶水解豬骨蛋白的最佳組合為A2B2C3D2，即酶活力5 000 U、酶解溫度50℃、酶解時間4.5 h、pH8.0。在此最佳條件下進行驗證試驗，得到的水解率為24.31%豬骨水解液。

3 結(jié)論

用堿性蛋白酶對豬骨蛋白進行酶解以制備富含氨基酸態(tài)氮的豬骨水解液，通過單因素試驗和正交試驗，得出堿性蛋白酶水解豬骨蛋白的最佳酶解條件為100 mL質(zhì)量分數(shù)10%的骨粉溶液環(huán)境中，酶活力5 000 U、酶解溫度50℃、酶解時間4.5 h、pH8.0。

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Hydrolysis technology of Sujiang porcine bone by alkaline protease

QU Guixiang,ZHAN Yueping,SHI Shuai,PU Lili,WANG Zhengyun

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China)

Hydrolysis process of Sujiang porcine bone by alkaline protease was investigated.On the basis of single factor experiment,orthogonal experiment was conducted using alkaline protease activity,hydrolysis temperature,time and pH as factors and hydrolysis degree as index value.Result showed that the optimum hydrolysis condition was bone powder solution concentration 10%,alkaline protease activity 5 000 U,temperature 50℃, time 4.5 h and pH 8.0.Under this condition,the hydrolysis degree was 24.31%.

enzymatic hydrolysis;Sujiang porcine bone;hydrolysis degree

TS251.94

A

0254-5071（2014）07-0088-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.019

2014-05-14

江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院院級青年基金項目（QN201026）

瞿桂香（1978-），女，講師，碩士，研究方向為功能性食品的研究與開發(fā)。