趙弼洲 ，田佳靈 ，余占海 ，胡永壽 ，馬海冰

1甘肅省中醫(yī)院口腔科，甘肅 蘭州 730050；2蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

淫羊藿苷(icariin，ICA)是植物淫羊藿莖葉中提取的總黃酮的主要有效成分。已有研究證實其可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［1-2］。人牙周膜細(xì)胞是一個混雜細(xì)胞群，其中的骨向分化亞群及未分化間、充質(zhì)細(xì)胞可在一定條件下增殖分化形成牙骨質(zhì)或牙槽骨，這是牙周修復(fù)再生的重要基礎(chǔ)［3-4］。骨鈣素(osteocal in，OCN)是細(xì)胞礦化過程中表達(dá)的標(biāo)志性蛋白，由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，可反映成骨細(xì)胞的活躍程度［5］。本研究通過探討淫羊藿苷對原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞OCN表達(dá)水平的影響，為其在治療牙周病方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 淫羊藿苷(中國藥品生物制品檢定所，批號：110737-200415)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；胰蛋白酶(Sigma，美國)；SP-9002免疫組化染色試劑盒(ZYMED，美國)；波形絲蛋白抗體、角蛋白多克隆抗體、DAB顯色液(北京中杉金橋生物有限公司)；抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松(Sigma，美國)；茜素紅S(上海生工生物技術(shù)公司)；人骨鈣素El isa試劑盒(R&D，美國)。

1.2 儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)；YJ-8175型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；Powerwave X自動酶標(biāo)分析儀(Bio-Tek，美國)。

1.3 人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 選擇12～14歲正畸患者減數(shù)拔除的健康前磨牙，在超凈工作臺內(nèi)，用無血清含雙抗的DMEM沖洗4～5遍。手術(shù)刀片刮取根中1/3牙周膜組織，置于離心管內(nèi)，滴加少量0.25%胰蛋白酶使離心管內(nèi)組織完全浸沒，37℃消化10分鐘，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化。800轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄去上清，留少量培養(yǎng)液。將殘留的少量培養(yǎng)液與組織塊一同吸出，轉(zhuǎn)移至35mm培養(yǎng)皿，將組織塊在培養(yǎng)皿底分散擺放，蓋玻片緩慢覆蓋組織塊，使培養(yǎng)液充盈于組織與蓋玻片之間。添加培養(yǎng)液2mL，將培養(yǎng)皿置二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，隔天觀察。每3天半量換液，待細(xì)胞生長鋪滿80%培養(yǎng)皿，消化后按1∶3傳代。選取第2代細(xì)胞按SP法細(xì)胞免疫化學(xué)染色，鑒定細(xì)胞來源。

1.4 茜素紅染色 取第2代人牙周膜細(xì)胞消化后輕輕吹打為細(xì)胞懸液，計數(shù)以5×104/mL密度接種于2塊6孔板，每孔2mL，培養(yǎng)24小時待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。一塊加入DMEM礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液 (含5%胎牛血清，10mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL抗壞血酸，1×10-8mol/L地塞米松)2mL。另一塊6孔板加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為對照組。每3天半量換液1次，培養(yǎng)21天。行茜素紅染色，觀察礦化結(jié)節(jié)。

1.5 人牙周膜細(xì)胞骨鈣素(OCN)表達(dá)水平的測定 將第3代人牙周膜細(xì)胞消化后以5×104/mL接種于24孔板，待細(xì)胞鋪滿24孔板底80%后棄去培養(yǎng)液，按藥物濃度分為6組，每組6孔，分別加入含 10、1、0.1、0.01、0.001、0μg/mL淫羊藿苷的DMEM礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液每孔1mL，繼續(xù)培養(yǎng)。72小時后吸取培養(yǎng)液上清，低溫3 000轉(zhuǎn)20分鐘離心后分裝，按人骨鈣素El isa試劑盒說明進(jìn)行操作，各濃度樣本設(shè)6個復(fù)孔，在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處檢測各樣本孔吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)物的吸光度值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線依據(jù)各樣本吸光度值計算出樣本濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況 培養(yǎng)4天左右，組織塊周圍可觀察到細(xì)胞游出。細(xì)胞呈梭形，胞核清晰，折光性好(圖1)；到第10天，組織塊周圍多處有細(xì)胞游出，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，在組織塊邊緣呈放射狀、螺旋狀走形(圖2)。

2.2 細(xì)胞鑒定 原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示：波形絲蛋白染色陽性，表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色著色；角蛋白染色陰性，未見著色，說明是中胚層來源細(xì)胞(圖3—4)。

圖1 培養(yǎng)4天的人牙周膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)（組織塊周圍出現(xiàn)細(xì)胞）(×100)

圖2 培養(yǎng)10天的人牙周膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)（細(xì)胞呈放射狀、旋渦狀走形）(×100)

圖3 原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞免疫化學(xué)染色圖（波形絲蛋白染色陽性）(×400)

圖4 原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞免疫化學(xué) 染色圖（角蛋白染色陰性）(×400)

2.3 茜素紅染色 隨培養(yǎng)時間的增長，細(xì)胞密度均逐漸增大，呈漩渦狀復(fù)層生長。行茜素紅染色后可見礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)組形成多處紅染礦化結(jié)節(jié)，而對照組僅可見到極少數(shù)紅染礦化結(jié)節(jié)，說明原代培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞可在礦化誘導(dǎo)條件下骨向分化，并形成細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)，見圖5—6。

圖5 礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)(×100)

圖6 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(×100)

2.4 淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞骨鈣素(OCN)表達(dá)水平的影響 人牙周膜細(xì)胞在礦化誘導(dǎo)條件下與不同濃度淫羊藿苷作用72小時后，1～0.01μg/mL組的OCN表達(dá)水平均較對照組顯著增加(P＜0.05)，0.001μg/mL組的OCN表達(dá)水平較對照組高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。10μg/mL組OCN表達(dá)水平較對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞OCN表達(dá)水平的影響(A450)

3 討論

牙周膜細(xì)胞在正畸牙移動過程中及牙周病或外傷所致牙周破壞的再生與修復(fù)中起重要作用［6-8］。Seo等［9］研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜細(xì)胞中存在一種具有高增殖能力、自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，這種細(xì)胞可在體內(nèi)形成牙周膜/牙骨質(zhì)樣組織。在不同培養(yǎng)條件下，這種細(xì)胞可分化為成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及膠原蛋白形成細(xì)胞［10-11］。在一定條件下體外培養(yǎng)可形成礦化結(jié)節(jié)，并表達(dá)成骨相關(guān)蛋白，如堿性磷酸酶、骨涎蛋白、骨鈣素等［12-14］。本研究將原代培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞在礦化誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)21天后，行茜素紅染色，可見有紅染的礦化結(jié)節(jié)形成，說明其在一定條件下，可骨向分化。一般認(rèn)為，形成骨樣礦化結(jié)節(jié)需要經(jīng)歷3個階段：增殖期，細(xì)胞外基質(zhì)成熟期以及礦化形成期［15］。

淫羊藿苷是中藥淫羊藿中提取的黃酮類天然藥物，具有抗腫瘤、增強免疫功能、改善心腦血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多重藥理作用［16］。體外研究已證實，淫羊藿苷可抑制破骨細(xì)胞分化及其功能，還可促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞骨向分化［17-18］。OCN是成骨細(xì)胞的特征性表型之一，其由成骨細(xì)胞產(chǎn)生,主要功能包括促進(jìn)骨的正常礦化，調(diào)節(jié)礦化成骨過程［5］。Shur l等［19］研究證實 OCN是牙體硬組織中一種重要的非膠原蛋白，牙周膜細(xì)胞也可合成分泌OCN，并能促進(jìn)牙槽骨和牙骨質(zhì)的礦化，是牙周組織修復(fù)再生的重要機制。本研究將人牙周膜細(xì)胞在礦化誘導(dǎo)條件下與不同濃度淫羊藿苷作用72小時后，El isa法檢查OCN表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，1～0.01μg/mL組的OCN表達(dá)水平均較對照組顯著增加(P＜0.05)，但不呈現(xiàn)濃度依賴性。10μg/mL組OCN表達(dá)水平較對照組低(P＜0.05)，可能是藥物毒性抑制了細(xì)胞的增殖與分化。

本研究結(jié)果表明，人牙周膜細(xì)胞具有骨向分化的能力，而一定濃度的淫羊藿苷可促進(jìn)骨向分化，可為其在促進(jìn)牙周組織修復(fù)再生方面的應(yīng)用研究提供依據(jù)，但具體作用機制仍不明確，有待進(jìn)一步研究證實。

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