劉 坤 劉維婕 李 薇

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連 116000

周圍神經(jīng)損傷是相應(yīng)脊髓節(jié)段也可發(fā)生一過(guò)性或者永久性的損傷，且可導(dǎo)致脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)發(fā)生凋亡等[1]。目前，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）以及GM1 的研究較多[2]。研究建立坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用NGF 與GM1，并設(shè)置生理鹽水對(duì)照組進(jìn)行了對(duì)比分析，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇鼠齡為6 個(gè)月的SD 大鼠5只，雌雄不限，體質(zhì)量在220～240g 之間，平均為（232.1±4.4）g。

1.1.2 試劑及儀器 GM1（香港精優(yōu)企業(yè)有限公司）、NGF（Sigma 公司）、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒（上海圻明生物科技有限公司）、多導(dǎo)生理記錄儀（Siemens AG）、JEM21200E 透射電子顯微鏡（日本電子光學(xué)公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型準(zhǔn)備 50只SD 大鼠，隨機(jī)分為A組（生理鹽水NS組，14只）、B組（NGF，12只）、C組（GM1，12只）和D組（NGF+GM1，12只），各組的定點(diǎn)觀察時(shí)相分別為傷后1周、4周及8周。大鼠均予以腹膜腔內(nèi)注射2%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，劑量為40mg/kg，并常規(guī)進(jìn)行消毒鋪單，于大鼠的右大腿外側(cè)行1 個(gè)縱向切口，以顯露其坐骨神經(jīng)，找到梨狀肌，于其下方5mm 部位切斷坐骨神經(jīng)，將遠(yuǎn)近神經(jīng)段均納入長(zhǎng)度為10mm、內(nèi)徑為2.0mm的硅膠管之中，然后以9-0 顯微縫線將神經(jīng)外膜固定在硅膠管的管壁上，保持神經(jīng)阻斷端之間相距5mm。手術(shù)過(guò)程中經(jīng)硅膠管滴加相應(yīng)藥物各1 次，手術(shù)后8周內(nèi)于小腿予以腓腸肌注射1 次，用量視體重而定，B組為NGF 用量10ng/100g，C組為GM1 用量100μg/100g，D組 為NGF 用量5ng/100g，GM1 用 量50μg/100g，A組予以等量的生理鹽水。

1.2.2 神經(jīng)傳導(dǎo)速度（NCV）的測(cè)定 各組分別于術(shù)后4周以及8周時(shí)選擇雙側(cè)坐骨神經(jīng)應(yīng)用生理記錄儀測(cè)定NCV，測(cè)定方法按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)測(cè)定 各組分別于術(shù)后1周、4周以及8周時(shí)選擇L1-6 脊髓前角進(jìn)行測(cè)定，常規(guī)進(jìn)行固定、包埋以及切片，控制片厚為5μm。然后進(jìn)行HE 染色，在各個(gè)標(biāo)本中抽取中間部位切片5 張，以直徑＞15μm 進(jìn)行計(jì)數(shù)，最終結(jié)果取平均數(shù)。同時(shí)，密切觀察并記錄脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)變化情況。

1.2.4 電鏡觀察 術(shù)后1、4周及8周時(shí)選擇L4-6 脊髓，采用3%的戊二醛進(jìn)行固定，并進(jìn)行定向包埋，選擇超薄切片此阿勇枸櫞酸鉛進(jìn)行染色，然后采用電鏡觀察并記錄其超微結(jié)構(gòu)，比較各組大鼠的超微結(jié)構(gòu)變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組NCV 比較

術(shù)后4周以及8周時(shí)，B、C、D組的NCV 均顯著優(yōu)于A組（P＜0.05）。在術(shù)后4周時(shí)，D組顯著優(yōu)于B、C組（P＜0.05）；在術(shù)后8周時(shí)，B、C、D 三組無(wú)明顯差異（P＞0.05），但顯著優(yōu)于A組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組NCV 比較(ms)

2.2 各組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目比較

術(shù)后1周和4周，D組的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目顯著高于A、B、C 三組（P＜0.05）,術(shù)后4周時(shí)B、C組顯著高于A組（P＜0.05）；術(shù)后8周時(shí)，B、C、D 三組無(wú)明顯差異（P＞0.05）,但顯著高于A組（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 各組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目比較

2.3 超微結(jié)構(gòu)變化

D組術(shù)后1、4周及8周時(shí)的細(xì)胞功能處于基本良好狀態(tài)，B組和C組的細(xì)胞存在部分萎縮，如假包含體以及核凹陷等；A組則表現(xiàn)為明顯細(xì)胞凋亡征象，如毒毛細(xì)胞以及脂質(zhì)體明顯增多等。

3 討論

近年來(lái)，雖然顯微外科技術(shù)得到了較大的進(jìn)展，但臨床療效多不理想[3]。神經(jīng)的再生速度極為緩慢，再生神經(jīng)還不能達(dá)到失神經(jīng)支配作用的肌肉組織時(shí)，該部位的肌肉即可產(chǎn)生不可逆性的肌萎縮[4]。因此，近年來(lái)臨床逐漸將周圍神經(jīng)損傷的治療重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至受損神經(jīng)保護(hù)方面，強(qiáng)調(diào)應(yīng)用多因素多因子防止神經(jīng)纖維、神經(jīng)元胞體以及神經(jīng)效應(yīng)器等的變性以及死亡，從而保護(hù)受損神經(jīng)元[5]。

NGF 屬于逆轉(zhuǎn)運(yùn)生長(zhǎng)因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，外源性NGF 能夠促進(jìn)神經(jīng)軸突再生。外源性GM1 能夠控制由于缺氧缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞水腫，并降低由于缺血缺氧引起的繼發(fā)性神經(jīng)損害，促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，從而促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)。但目前多數(shù)研究都限于單純應(yīng)用NGF 或GM1 的研究，對(duì)于兩者聯(lián)合應(yīng)用的研究相對(duì)較少。

本研究建立坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用NGF與GM1，同時(shí)以生理鹽水作為對(duì)照，研究了NGF 聯(lián)合GM1 對(duì)于坐骨神經(jīng)損傷以后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，神經(jīng)損傷大鼠在術(shù)后4周時(shí)無(wú)論是神經(jīng)傳導(dǎo)速度還是脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)均顯著優(yōu)于單純NGF組或GM1組，且在術(shù)后1-8周內(nèi)，NGF 聯(lián)合GM1組的細(xì)胞功能基本保持良好，而其余各組均存在不同程度的萎縮或凋亡。充分證實(shí)，對(duì)于周圍神經(jīng)損傷應(yīng)用NGF 聯(lián)合GM1 可防止神經(jīng)元的壞死，并促進(jìn)神經(jīng)元的再生以及結(jié)構(gòu)改變的恢復(fù)，且起效時(shí)間較單純應(yīng)用NGF 或GM1 明顯提前。

綜上所述，在坐骨神經(jīng)損傷早期，聯(lián)合應(yīng)用NGF 和GM1 能夠加速神經(jīng)元的修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)元再生以及結(jié)構(gòu)功能的回顧，并早期抑制細(xì)胞的凋亡，有效縮短受損神經(jīng)的修復(fù)時(shí)間，改善患者的預(yù)后及生活質(zhì)量，值得推廣應(yīng)用。

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[2]許輝,羅潔.鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯治療周圍神經(jīng)損傷的療效觀察[J].江西醫(yī)藥,2010,45(8)：765-766.

[3]翟宏偉,孫潔,鞏尊科，等.神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療對(duì)脊髓損傷后生活自理能力恢復(fù)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2013,35(3)：185-187.

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[5]張紅,宋美香,孫向偉，等.神經(jīng)干細(xì)胞移植結(jié)合注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療脊髓損傷的護(hù)理[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)（中旬刊）,2012,(12)：208.