李丹彤，范友敏，常亞青，李曉麗，侯建華，曲誠，胡昕江

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

刺參Apostichopus japonicus作為棘皮動(dòng)物門海參綱的一種，壁厚味美，營養(yǎng)豐富，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身和藥用功能［1］。海參體壁因含有海參多糖、膠原蛋白和海參皂苷等多種生理活性物質(zhì)而成為海參主要的食用和藥用部位，其藥理活性主要包括抗真菌［2］、抗腫瘤［3］、抗凝血［4］、調(diào)節(jié)血脂濃度［5］和抗疲勞等作用［6］。20世紀(jì)80年代以來，隨著國內(nèi)對刺參產(chǎn)品需求的增多，刺參已成為中國北方主要的海水養(yǎng)殖品種，但隨著中國刺參大規(guī)模人工養(yǎng)殖的快速發(fā)展，病害問題日趨突出。目前，養(yǎng)殖業(yè)中防治病害普遍使用一些抗生素和化學(xué)藥物，但這些藥物易在刺參體內(nèi)殘留，影響刺參的食用品質(zhì)。因此，提高刺參自身的抗病力是防治刺參暴發(fā)疾病、保證刺參優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的根本途徑之一。Pedro等［7］采用脂多糖 (LPS)可以增強(qiáng)海參體腔細(xì)胞的吞噬活性;江曉路等［8］采用褐藻寡糖，王東梅等［9］采用復(fù)方中草藥等均可提高刺參免疫活性;熊川男等［10］認(rèn)為，利用凝集素作為海參免疫增強(qiáng)劑是防治海參病的一條有效途徑。

凝集素是一類具有糖專一性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白，具有抗菌、激活淋巴細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種功能。Eliseikina等［11］已成功地利用甘露聚糖特異性凝集素來提高海參等棘皮動(dòng)物抗假結(jié)核耶爾森氏菌 (Yersinia Dseudotuberculosis)的能力。Eddie Ip等［12］研究表明，甘露糖結(jié)合凝集素 (MBL)與TLR2/6異聚體的協(xié)同作用能夠特異性地增強(qiáng)宿主金黃色葡萄球菌的應(yīng)答。李丹彤等［13-17］研究了裙帶菜、條斑紫菜、孔石莼和萱藻凝集素提取液對日本對蝦、鯉、鯽和刺參非特異性免疫功能的影響，劉云等［18］研究了兩種免疫多糖對刺參組織主要免疫酶活性的影響，均發(fā)現(xiàn)其具有明顯的增強(qiáng)作用。海帶和條斑紫菜的生物量較大，且其凝集素提取液活性較高，而有關(guān)凝集素提取液對刺參免疫活性物的誘導(dǎo)作用的報(bào)道較少。本研究中探究了海帶和條斑紫菜凝集素提取液對刺參組織主要免疫酶活性的影響，以期為水產(chǎn)動(dòng)物病害防治開辟一條新的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參購自大連皮口養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為(3．50 ±1．95)g，體長為 (4．05 ±0．95)cm。購回后暫養(yǎng)于水槽 (30 L)中，共飼養(yǎng)14箱 (20頭/箱)。暫養(yǎng)期間，水溫為14℃，pH為8．0，海水鹽度為33，每日9:00投喂1次幼參配合飼料(購于山東省蓬萊市蓬源飼料公司)并換水40%，7 d后用于試驗(yàn)。

試驗(yàn)用新鮮海帶長約1 m，新鮮條斑紫菜長約30 cm，均購買于大連市黑石礁市場。試驗(yàn)用兔購于大連醫(yī)科大學(xué)。

1.2 方法

1．2．1 凝集素提取液的制備 將海帶和條斑紫菜用過濾海水洗凈，用紗布和濾紙吸去水分，放入冰箱 (-20℃)中冷凍，然后置于干燥機(jī)中烘干(45℃)。將烘干的海帶、條斑紫菜用研缽研磨成粉末，放入自封袋內(nèi)保存。以1∶16(g∶mL)的比例將干粉用含 0．15 mol/L NaCl的 0．015 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液 (pH 7．2)于4℃下浸泡16 h，間歇性適當(dāng)攪拌，混合液倒入離心管中，在4℃下以4000 r/min離心30 min，離心后得到的上清液即為凝集素提取液。

1．2．2 蛋白含量的測定 參照文獻(xiàn) ［19］中的方法，用紫外分光光度計(jì)測定 (用A280nm表示)，蛋白含量的測定用牛血清白蛋白作對照。

1．2．3 凝集活性的測定 從兔子的耳緣靜脈抽取兔血，用生理鹽水將其配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸液。在96孔V形血凝板上用40 μL生理鹽水和等量的凝集素提取液倍比稀釋后，加入40 μL 2%的紅細(xì)胞懸液，混勻并測定血凝活性。室溫下放置2 h后，若觀察到紅細(xì)胞沉積在V型孔底部呈大紅點(diǎn)狀，則說明無凝集現(xiàn)象，若紅細(xì)胞呈網(wǎng)狀不下沉，表示有凝集現(xiàn)象。用能產(chǎn)生凝集現(xiàn)象的凝集素最大稀釋倍數(shù)或最小凝集素的量來表示血凝活性。

1．2．4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)7組，每組設(shè)10個(gè)重復(fù)，每組放40頭刺參，在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0．64%、1．28%、2．56%的海帶凝集素提取液，或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1．88%、3．76%、7．52%的條斑紫菜凝集素提取液，分別投喂6個(gè)試驗(yàn)組刺參，以基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)組為對照。每天9:00換水1次，每次換水量為1/3～1/2，每天換水后投喂飼料 (投喂量按刺參體質(zhì)量的3% ～4%)，并測量鹽度、pH、溫度等各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)，分別在投喂凝集素提取液后的第4、8、12、17天時(shí)測定刺參組織的各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1．2．5 樣品的制備 每次從各組取刺參10頭，測量其體長，用滅菌的剪刀從刺參肛門沿腹處剪開，用濾紙吸干體腔液，取體壁稱重。按1∶3(g∶mL)的比例加入生理鹽水，用勻漿器研磨，在4℃下以12 000 r/min離心30 min，取上清，置于冰箱 (4℃)中保存?zhèn)溆?，試?yàn)中每只刺參均單獨(dú)測定免疫酶活性。

1．2．6 免疫酶活性的測定 CAT活性的測定依照桂遠(yuǎn)明等［20］的方法。CAT酶活力單位定義為:每分鐘分解1 μmol的過氧化氫 (H2O2)的量為1個(gè)酶活力單位 (U)。

LSZ活性的測定依照王雷等［21］的方法，用0．1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液 (pH 6．4)配成溶壁微球菌懸液 (A570nm=0．3)。取3 mL該懸液于試管中冰浴10 min后加入50 μL待測液，混勻，于570 nm波長處測定 A0值，再將試液于37℃下水浴30 min，之后冰浴10 min中止反應(yīng)，測定反應(yīng)后的試液在570 nm波長處的光密度值A(chǔ)。溶菌酶活力的計(jì)算公式為

AKP活力的測定采用磷酸苯二鈉法［20］。AKP酶活力單位定義為:樣品在37℃下與底物作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酶活力單位 (U)。

ACP活力的測定采用磷酸苯二鈉法［20］。ACP酶活力單位定義為:樣品在37℃下與底物作用60 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酶活力單位 (U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13．0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝集素提取液的制備

在45℃下烘干海帶和條斑紫菜，制備海帶和條斑紫菜凝集素提取液，測得海帶凝集素提取液比活力為條斑紫菜凝集素提取液的1517．31倍 (表1)。

表1 海帶與條斑紫菜凝集素提取液的分離測定結(jié)果Tab.1 Separation of kelp Laminaria japonica Aresch and laver Porphyra yezoensis Veda lectins

2.2 海藻凝集素提取液對刺參體壁中CAT活性的影響

從表2可見:投喂含海帶凝集素提取液的飼料后，除第4天時(shí)各試驗(yàn)組幼參的CAT活性小于對照組外，其余時(shí)間均比對照組高;第8天時(shí)，除2．56%試驗(yàn)組酶活性與對照組呈顯著性差異 (P＜0．05)外，其他試驗(yàn)組均與對照組呈極顯著性差異 (P＜0．01);第12天時(shí)，0．64%和1．28%試驗(yàn)組酶活性均與對照組呈極顯著性差異 (P＜0．01)且1．28%試驗(yàn)組酶活性最高，為對照組酶活性的1．11倍;第17天時(shí)，1．28%和2．56%凝集素對刺參體壁CAT活性具有顯著的誘導(dǎo)作用 (P＜0．05)。

投喂含條斑紫菜凝集素提取液的飼料后，第8天時(shí)各試驗(yàn)組刺參體壁CAT活性均有極顯著提高(P＜0．01);第12天時(shí)，1．88%組CAT活性有極顯著提高 (P＜0．01)且酶活性最高，為對照組酶活性的1．10倍，而3．76%和7．52%組酶活性均呈顯著提高 (P＜0．05);第17天時(shí)，試驗(yàn)組CAT酶活性均有顯著提高 (P＜0．05)。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來看，在投喂含海帶和條斑紫菜凝集素提取液飼料的中后期，各組刺參體壁的CAT酶活性均顯著或極顯著提高。

2.3 海藻凝集素提取液對刺參體壁中LSZ活性的影響

從表2可見:投喂海帶凝集素提取液后，第8天時(shí)，0．64%和2．56%組刺參LSZ活性顯著提高(P＜0．05)，而1．28%組則呈現(xiàn)極顯著提高 (P＜0．01);第12天和第17天時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組均有極顯著提高 (P＜0．01)，2．56%組在第17天時(shí)活性達(dá)到最高，是對照組的2．25倍。投喂條斑紫菜凝集素提取液后，僅7．52%組刺參LSZ活性在第8天時(shí)顯著提高 (P＜0．05)，其他3個(gè)試驗(yàn)組酶活性在第4、8、12、17天時(shí)均與對照組無顯著性差異 (P ＞0．05)。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來看，投喂不同含量的海帶凝集素提取液，隨著時(shí)間的增加LSZ活性均顯著或極顯著提高，且比條斑紫菜凝集素提取液對刺參體壁LSZ活性的誘導(dǎo)作用大。

表2 海帶和條斑紫菜凝集素提取液對刺參體壁CAT和LSZ活性的影響 (n=10)Tab.2 Effects of kelp Laminaria japonica Aresch and laver Porphyra yezoensis Veda lectin extracted solution on catalase(CAT)and lysozyme(LSZ)activities in body walls of sea cucumber Apostichopus japonicus(n=10)

2.4 海藻凝集素提取液對刺參體壁中AKP活性的影響

從表3可見:投喂含海帶凝集素提取液的飼料后，試驗(yàn)組幼參的AKP活性在第4、8、12、17天時(shí)均無顯著提高 (P＞0．05);投喂含條斑紫菜凝集素提取液飼料后，第4、17天時(shí)，7．52%組AKP活性極顯著提高 (P＜0．01)且在第4天時(shí)活性最高，其酶活性是對照組的1．42倍;第8、12天時(shí)3個(gè)試驗(yàn)組的酶活性在投喂期間無顯著性變化(P ＞0．05)。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來看，投喂7．52%條斑紫菜凝集素提取液，AKP活性均比對照組高，并在第4、17天時(shí)有極顯著性差異，且比海帶凝集素提取液對刺參體壁AKP的誘導(dǎo)作用大。

2.5 海藻凝集素提取液對刺參體壁中ACP活性的影響

從表3可見:投喂含海帶凝集素提取液的飼料后，第4天時(shí)試驗(yàn)組的ACP活性均低于對照組;第8、17天時(shí)僅0．64%組比對照組顯著提高 (P＜0．05)且在第17天時(shí)ACP活性最高，其酶活性是對照組的1．26倍。投喂含有條斑紫菜凝集素提取液的飼料后，第4、8天時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組ACP活性均與對照組無顯著性差異 (P＞0．05);第12天時(shí)，試驗(yàn)組與對照組相比ACP活性均有所提高，其中7．52%組有極顯著性變化 (P＜0．01);第17天時(shí)，1．88%組和7．52%組酶活性較對照組極顯著提高 (P＜0．01)，3．76%組有顯著提高 (P＜0．05)，7．52%試驗(yàn)組在第12天時(shí)和第17天時(shí)分別為對照組的1．43倍和1．57倍。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來看，投喂含條斑紫菜凝集素提取液飼料的后期，對刺參體壁ACP活性的影響明顯，比投喂含海帶凝集素提取液飼料的效果顯著。

表3 海帶和條斑紫菜凝集素提取液對刺參體壁AKP和ACP活性的影響 (n=10)Tab.3 Effects of kelp Laminaria japonica Aresch and laver Porphyra yezoensis Veda lectin extracted solution on alkaline phosphatase(AKP)and acid phosphatase(ACP)activities in body walls of sea cucumber Apostichopus japonicus(n=10)

3 討論

海帶屬于褐藻門、海帶科的一種常見食用海洋經(jīng)濟(jì)藻類，條斑紫菜屬于紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜科、Pyropia屬。兩種海藻凝集素提取液對刺參體壁4種酶活性的研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組中加入海帶和條斑紫菜凝集素提取液能顯著提高刺參體壁中CAT、LSZ、AKP和ACP的活性，且最高酶活的最佳凝集素提取液濃度和誘導(dǎo)時(shí)間不同。這表明，海藻凝集素提取液是對刺參機(jī)體具有顯著免疫誘導(dǎo)功效的一種天然免疫增強(qiáng)劑。

CAT酶是存在于生物體內(nèi)非常重要的抗氧化防御性功能酶，體內(nèi)SOD清除過量O-2·產(chǎn)生過量的H2O2，H2O2可由CAT與谷胱甘肽過氧化物酶等一起消除，從而維持機(jī)體正常的機(jī)能［22］。本研究中，在投喂含不同含量的海帶和條斑紫菜凝集素提取液飼料的中后期，刺參體壁CAT酶活性均顯著或極顯著提高，說明機(jī)體抗氧化能力顯著提高。

LSZ酶是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要參與機(jī)體中非特異性免疫的殺菌作用，水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷鍵。當(dāng)機(jī)體受到病原等外界刺激時(shí)，吞噬細(xì)胞活性增強(qiáng)并進(jìn)行異物吞噬，因吞噬細(xì)胞含有LSZ，此時(shí)LSZ活性也隨之變化［23-24］。本研究中，投喂不同含量的海帶凝集素提取液，隨著時(shí)間的增加LSZ活性均顯著或極顯著提高，這一結(jié)果與李丹彤等［17］研究的萱藻和裙帶菜凝集素提取液作為免疫增強(qiáng)劑對刺參進(jìn)行免疫誘導(dǎo)所得結(jié)論相近。海帶凝集素提取液促進(jìn)刺參LSZ活性上升的原因，可能是當(dāng)用含海帶凝集素提取液的飼料投喂刺參后，可激活吞噬細(xì)胞的吞噬功能和LSZ活性，刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，啟動(dòng)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)刺參免疫能力［25］。金思等［26］在試驗(yàn)飼料中添加不同濃度的殼聚糖后測定香魚LSZ活性和hsp70基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香魚肝臟、脾臟和腎臟中hsp70的表達(dá)量均較對照組升高，投喂殼聚糖后LSZ活性與hsp70的表達(dá)量呈正相關(guān)。hsp70基因家族是最重要且被最廣泛研究的熱激蛋白基因家族，參與生物體的多種免疫應(yīng)答過程，推測海帶凝集素提取液提高刺參LSZ活性與hsp70有一定的相關(guān)性。

AKP酶在體內(nèi)細(xì)胞代謝過程中具有重要作用，可以催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，還可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。其不僅參加鈣磷代謝，維持體內(nèi)適宜的鈣磷比例，而且還與貝類角蛋白等蛋白質(zhì)的分泌相關(guān)［27］，同時(shí)其作為軟體動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［28-29］。本研究中，投喂7．52%條斑紫菜凝集素提取液后，AKP活性有顯著提高，且比海帶凝集素提取液對刺參體壁AKP的誘導(dǎo)作用大，推測條斑紫菜凝集素提取液可以通過提高AKP活性，提高刺參免疫活性。由于條斑紫菜凝集素提取液與海帶凝集素提取液的結(jié)構(gòu)組成不同，造成其對刺參體壁AKP活性的激活作用也不同。

ACP酶是溶酶體的重要組成部分，是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，可用ACP活性表示吞噬細(xì)胞清除異物的能力［9］。本研究中，投喂條斑紫菜和海帶凝集素提取液的中后期，ACP活性均有顯著或極顯著提高，且在后期投喂條斑紫菜比投喂海帶凝集素提取液提高得更顯著。Rawal等［30］研究表明，阿米巴Gal/GalNAc專一凝集素對MAPK激酶途徑有激活作用，MAPK進(jìn)入細(xì)胞核，可使其轉(zhuǎn)錄因子活化。由此推測，這可能也是條斑紫菜和海帶凝集素提取液顯著提高刺參ACP活性的機(jī)理，有待于進(jìn)一步研究。

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