秦力維，張寧坤，郭建巍，彭秀軍，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，高 原

·生物樣本庫·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的高效分離及對小鼠免疫功能的影響

秦力維，張寧坤，郭建巍，彭秀軍，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，高 原

目的建立一種從健康人臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的簡單、經(jīng)濟(jì)、高效方法，并探討其對小鼠免疫細(xì)胞的影響。方法取經(jīng)剖宮產(chǎn)獲得的健康人臍帶血管與外膜之間的膠狀物并剪切成小于1mm3的小塊，用組織塊貼壁法直接培養(yǎng)MSCs，并用獲得的MSCs注射于健康C57 BL/6小鼠皮下。結(jié)果獲得的MSCs高表達(dá)CD105、CD73、CD44和CD90，不表達(dá)CD34、CD45和人類白細(xì)胞抗原-DR，符合干細(xì)胞的各種生物學(xué)特性。結(jié)論用簡便、經(jīng)濟(jì)的方法獲得了健康人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，注射C57 BL/6小鼠體內(nèi)后，小鼠的血細(xì)胞及T細(xì)胞亞型未改變，自身免疫系統(tǒng)穩(wěn)定，為進(jìn)一步的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；直接貼壁法；異種注射

[注 明]秦力維，張寧坤:并列第一作者DMEM)培養(yǎng)基(美國，HyClone公司)、青霉素和鏈霉素(美國，HyClone公司)、胎牛血清(美國，Gibco公司)；生物安全柜(美國，Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國，Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本，Olympus公司)；普通離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)；恒溫水浴箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；一次性無菌培養(yǎng)瓶、離心管、移液管、過濾器(美國，Gibco公司)。

FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(美國，Becton Dickinson公司)，功率15 W，激光光源采用氬離子氣體激光器，波長488 nm，進(jìn)行藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、甲藻葉綠素蛋白(peridinin chlorophyll protein，PerCP)等檢測；另配小功率半導(dǎo)體激光器，波長為635 nm，別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)檢測。全自動血球分析儀(日本，Sysmex公司)。18～20 g雌性C57 BL/6 30只wide type(WT)小鼠購自海軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK-(京)-2011-0006]。1.2 試劑配制 DMEM完全培養(yǎng)基:90 mL DMEM培養(yǎng)基＋20 mL特級胎牛血清(100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)。

1.3 方法

1.3.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離 無菌取剖宮產(chǎn)新鮮臍帶，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗去臍帶殘留血液，剪成3～4 cm的小段，每一段沿靜脈腔剪開，平鋪后剔除臍帶動、靜脈；取血管之間血管與外膜之間的膠狀物，并剪切成小于1 mm3小塊，以PBS沖洗后，把組織塊放置含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 倒置相差顯微鏡下觀察組織塊，24 h后半量換液，待組織塊周圍均有細(xì)胞出現(xiàn)時，移出組織塊；當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增占80%～90%細(xì)胞瓶底面積時，用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸液消化后傳代，用0.01 mol/L PBS調(diào)整細(xì)胞為5×105/mL，0.01 mol/L PBS洗滌2次后，加入PBS 1 mL重懸細(xì)胞，取1×106個細(xì)胞待用。用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定 取1×106個細(xì)胞，加100μL的細(xì)胞染色緩沖液，根據(jù)抗體說明書加入相應(yīng)體積的抗體[小鼠抗人PE、APC或FITC標(biāo)志的單抗CD105、CD73、CD44、CD90、CD34、CD45和人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-DR]，室溫孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500μL PBS上機(jī)檢測。

1.3.4 分組 用無菌PBS調(diào)整臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至1×106/mL，隨機(jī)數(shù)字法將30只雌性小鼠分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，每組15只。實(shí)驗(yàn)組于每只小鼠腹股溝皮下多點(diǎn)注射MSCs細(xì)胞液，每只注射0.5 mL，連續(xù)注射3 d；對照組腹股溝皮下多點(diǎn)注射PBS 0.5mL。7 d后尾靜脈取血檢測小鼠血常規(guī)，處死后流式細(xì)胞儀檢測外周血細(xì)胞、脾細(xì)胞T細(xì)胞亞群變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)至第7天時，倒置相差顯微鏡下觀察到臍帶組織塊周圍有成纖維樣細(xì)胞爬出，移出組織塊后，可見大量貼壁細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣較鈍，細(xì)胞間雜質(zhì)較多。培養(yǎng)第10天，細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，細(xì)胞間雜質(zhì)消失，細(xì)胞邊緣光滑，呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。傳代至第3代時，細(xì)胞內(nèi)外不見明顯顆粒，細(xì)胞表面光滑、狀態(tài)良好(圖1)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 倒置相差顯微鏡下的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(×200)

2.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型的鑒定 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD105(90.0%)和CD44 (99%)、CD73(85.1%)和CD90(99.5%)，很少表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34(0.32%)、CD45(0.27%)和HLA-DR(1.03%)。見圖2～6。

圖2 CD105和CD44分子在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面的表達(dá)

圖3 CD73和CD90分子在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面的表達(dá)

圖4 CD34分子在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面的表達(dá)

圖5 CD45分子在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面的表達(dá)

圖6 HLA-DR分子在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面的表達(dá)

2.3 小鼠外周血細(xì)胞、脾細(xì)胞T細(xì)胞亞群的變化

小鼠腹股溝皮下多點(diǎn)注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞7 d后，尾靜脈取血進(jìn)行血常規(guī)檢測；結(jié)果顯示，與對照組相比，小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)；實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，脾臟CD3＋CD4＋細(xì)胞、CD3＋CD8＋細(xì)胞數(shù)量、CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

表1 注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后小鼠外周血細(xì)胞的變化

表2 注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后小鼠脾細(xì)胞T細(xì)胞亞群的變化

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層的間充質(zhì)，分布廣泛，形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似，是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，已在組織工程領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在特性上類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但在增殖及分化潛能方面優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且易于獲得、取材方便，排除了倫理道德方面限制，容易工業(yè)化制備，是組織工程和再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞[1]。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)一般采用酶消化法、組織塊貼壁法和兩者聯(lián)合的方法[2-3]。我們在長期研究中發(fā)現(xiàn)，用酶消化法分離臍帶干細(xì)胞時使用大量的Ⅱ型膠原酶，這種方法耗時長達(dá)20 h。由于Ⅱ型膠原酶的大量使用，使組織消化過程不易控制，常導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，表面受體降解甚至功能改變。實(shí)驗(yàn)中使用的膠原酶均為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格不菲，使實(shí)驗(yàn)成本增加。

本研究中，將要培養(yǎng)的臍帶組織塊剪切成小于1 mm3大小的小塊，經(jīng)PBS充分洗滌后，使用組織塊直接貼壁培養(yǎng)，在處理及培養(yǎng)過程中不使用0.2%Ⅱ型膠原酶，同時在培養(yǎng)液中加大胎牛血清至15%，加速了組織塊的貼壁。這種方法使組織塊中的干細(xì)胞能在48 h左右爬出并貼壁，增加了細(xì)胞生長的速度。換液過程中充分利用干細(xì)胞生長過程中分泌的各種細(xì)胞及組織生長因子，進(jìn)行半量換液，始終使細(xì)胞處于有細(xì)胞和組織生長因子的狀態(tài)，使細(xì)胞生長狀態(tài)良好，增殖加快。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞鏡下呈長梭形或多角形，平行生長或漩渦狀生長，高表達(dá)CD105、CD73、CD44和CD99，不表達(dá)CD34、CD45和HLA-DR，符合干細(xì)胞的各種生物學(xué)特性[4]。

近年來，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在組織損傷的治療中得到了很多應(yīng)用。有學(xué)者將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植給視網(wǎng)膜疾病的嚙齒目動物，可挽救其光感受器，效果優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞移植[5]；可顯著降低心搏驟停復(fù)蘇所致的腦缺血大鼠神經(jīng)元的喪失[6]；可改善脫水誘導(dǎo)的帕金森病大鼠動作的缺陷[7]。由于免疫原性低，同種異體移植無免疫排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱，已有異種移植對自身免疫性疾病的防治[8]及治療糖尿病[9]、肝損傷[10]方面的研究報(bào)道。

在眼科疾病的研究中，MSCs有利于視網(wǎng)膜色素變性和視網(wǎng)膜光損傷的治療[11-12]；它具有神經(jīng)保護(hù)作用，可減輕或延緩視網(wǎng)膜組織損傷，在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷和青光眼的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[13-14]；MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)作用，它可抑制脈絡(luò)膜新生血管生長并促進(jìn)其消退[12]。在后續(xù)研究中，我們將用獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)動物的各種眼科疾病的研究。

相對于實(shí)驗(yàn)動物來說，人MSCs是異種來源的細(xì)胞，對于來源于不同人體、不同培養(yǎng)方式得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，重復(fù)多次輸注，受體動物是否安全、是否產(chǎn)生免疫原性?帶著這個問題，本研究將獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞注入健康小鼠，7 d后對其血細(xì)胞及脾細(xì)胞T細(xì)胞亞群進(jìn)行了分析測定，結(jié)果顯示注入臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后小鼠的血細(xì)胞及免疫細(xì)胞表型均沒有明顯的改變，進(jìn)一步證實(shí)了有關(guān)研究的結(jié)果[15]，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

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Effective isolation of human umbilical cord mesenchymal stemcells and immunity changes after injection in mice

QIN Liwei1，ZHANG Ningkun2，GUO Jianwei3，PENG Xiujun1，WANG Guiqin1，CAO Liqun1，TIAN Chunyu1，CUIBei1，WANG Jing1，GAO Yuan1
(1.Department of Ophthalmology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Heart Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；3.Department of Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo explore an effective，convenient and economicalmethod for extraction and cultivation human umbilical cord mesenchymal stem cells(MSCs)and discussion changes of peripheral blood cells and T lymphocyte subgroups in C57 BL/6 mice after MSCs infection.MethodsUnder sterile conditions，umbilical artery and vein were excluded from cesarean section fetal umbilical cord，cut umbilical cord into shiver smaller than 1 mm3and cultured in vitro until getting adherent cells.5×106MSCs were injected subcutaneously in C57 BL/6 mice for 3 days.ResultsMSCs were effectively isolated from human umbilical cord with high expression CD105，CD73，CD44 and CD90moleculars，but less expression for CD34，CD45 and human leucocyte antigen-DR moleculars.ConclusionAn effective，convenient and economical method to isolate and culture MSCs in vitro was successfully established.No changeswere detected in peripheral blood cells and T lymphocyte subgroups of C57 BL/6 mice after MSCs infection.

Umbilical cord；Mesenchymal stem cells(MSCs)；Direct adherent cells；Xerogeneic injection

R329

A

2095-3097(2014)06-0333-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2014.06.004

1 材料與方法

海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培育基金資助(CXPY201312)

100048北京，海軍總醫(yī)院眼科(秦力維，彭秀軍，王桂琴，曹利群，田春雨，崔 蓓，王 靜，高 原)，心臟中心(張寧坤)，檢驗(yàn)科(郭建巍)

高 原，E-mail:gaoyuan999＠sina.con

2014-05-27 本文編輯:馮 博)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新及多向分化潛能的干細(xì)胞，廣泛存在于成體及胎兒的各種組織中，在組織再生和修復(fù)中具有重要作用。由于來源于成體組織MSCs數(shù)量有限，限制了其臨床應(yīng)用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，來源于臍帶的MSCs具有更強(qiáng)的增殖效力和自我更新能力，是再生醫(yī)學(xué)理想種子細(xì)胞[1]。本研究擬建立一種從健康人胎盤臍帶中分離MSCs的簡單、經(jīng)濟(jì)、高效方法，并探討其對小鼠免疫細(xì)胞的影響，為MSCs的廣泛使用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.1 材料與儀器 新生兒臍帶取自海軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科(37～40周胎齡剖宮產(chǎn)健康胎兒)。達(dá)爾伯克改良伊格爾(Dulbecco′smodification of Eagle′smedium，