朱擇敏，馬冬梅，白俊杰，樊佳佳，廖國禮，梁旭方

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶魚類選育與養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510380;2.暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系，廣東 廣州510632)

大口黑鱸Micropterus salmoides 又名加州鱸，是一種原產(chǎn)于北美的廣溫性肉食性魚類，目前，大口黑鱸的養(yǎng)殖主要靠投喂冰鮮雜魚，開發(fā)適合的人工配合飼料已成為大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點(diǎn)。喂食人工配合飼料的大口黑鱸肝臟易受到損傷［1］，因此，開展飼料中脂肪含量對(duì)魚體生長、脂肪代謝及其基因表達(dá)影響的研究具有重要意義。

脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)的作用主要是催化乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，產(chǎn)生供機(jī)體組織利用的脂肪酸和單酰甘油［2-3］。大口黑鱸兩種LPL 的全長cDNA 已得到克隆，并運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR 方法檢測了脂蛋白脂肪酶mRNA 的組織分布，發(fā)現(xiàn)LPLtype1和LPLtype2均在肝臟中表達(dá)量最高，這可能與肝臟是最主要的營養(yǎng)誘導(dǎo)性貯脂部位有關(guān)［4］。

有關(guān)飼料中不同脂肪水平對(duì)大口黑鱸營養(yǎng)吸收、生長、肌肉組織成分、非特異性免疫，以及與生長相關(guān)的基因表達(dá)影響的研究已有報(bào)道［5-8］，但從分子水平分析飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸脂肪代謝的研究還很少。本研究中，不僅檢測了不同脂肪水平飼料對(duì)大口黑鱸生長性能的影響，還從分子水平檢測了對(duì)肝臟中兩個(gè)脂蛋白脂肪酶基因mRNA表達(dá)量的影響，分析了飼料中的脂肪含量與生長及肝臟脂肪代謝基因的相互關(guān)系，旨在為研究大口黑鱸對(duì)外源脂肪的適應(yīng)和調(diào)節(jié)能力提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所良種基地人工繁殖大口黑鱸，體質(zhì)量約為40 g。

1.2 方法

1.2.1 人工配合飼料的制備 試驗(yàn)用冰鮮雜魚為冰凍的藍(lán)圓鲹Decapterus maruadsi，俗名池魚。A、B 兩種人工配合飼料的魚油添加量分別為6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)和12%，面粉添加量分別為20%、14%，其余原料均為進(jìn)口魚粉42%、國產(chǎn)魚粉10%、豆粕15%、復(fù)合維生素1%、復(fù)合礦物質(zhì)4%、烏賊膏2%，將各原料充分混勻，用制粒機(jī)制成直徑為4.5 mm 的顆粒飼料，制粒溫度為40 ～45 ℃，自然風(fēng)干，過篩后于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。?jīng)測定，A、B 兩種配合飼料和冰鮮雜魚的粗脂肪含量分別為8.2%、14.5%和4.4%，占各飼料干質(zhì)量的8.9%、15.7%和12.3%(表1)。

表1 各組飼料營養(yǎng)組分Tab.1 Approximate composition of the test diets w/%

1.2.2 飼養(yǎng)管理 選擇健康的大口黑鱸270 尾，隨機(jī)分為3 組，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，分別放入已消毒的水泥池(8 m3)中養(yǎng)殖，每池30 尾。3 組分別喂食冰鮮雜魚、A 配合飼料和B 配合飼料。養(yǎng)殖條件相同，飼料用水均為充分曝氣的自來水，每兩天進(jìn)行一次排污，測量水溫和pH 值，并根據(jù)水質(zhì)的具體情況換30% ～50%的曝氣水，每日上、下午各投喂1次，少量投餌，喂食至魚不再搶食為止，飼養(yǎng)試驗(yàn)共進(jìn)行3 個(gè)月。試驗(yàn)過程中計(jì)算試驗(yàn)魚的存活率，測量每組魚的初始平均體質(zhì)量(W0)和終末平均體質(zhì)量(Wt)，并按下式計(jì)算［9-10］:

1.2.3 肝臟中兩種LPL mRNA表達(dá)量的檢測 飼養(yǎng)結(jié)束后，停食24 h。從對(duì)照組和試驗(yàn)組分別取6尾大口黑鱸，用MS222 麻醉，取其肝臟，用TRIzol(Invitrogen，USA)快速提取肝臟總RNA。以18S作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物(表2)，用ABI 7300 型熒光定量PCR 儀檢測大口黑鱸LPLtype1和LPLtype2 mRNA在各組大口黑鱸肝臟中的表達(dá)量。熒光定量所得數(shù)據(jù)，用2-△△CT法計(jì)算LPL 基因的相對(duì)表達(dá)量，用Excel 軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。

表2 引物序列Tab.2 Primers in the study

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸生長的影響

從表3可見:喂食冰鮮雜魚的對(duì)照組大口黑鱸的平均體質(zhì)量增加率最大，為139.15%，與喂食B配合飼料和A 配合飼料的組存在顯著性差異(P＜0.05)，喂食冰鮮雜魚組的大口黑鱸生長速度明顯快于喂食人工配合飼料的魚。

表3 飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸存活率和生長速度的影響Tab.3 Effcets of dietary lipid levels on survival and growth rate of large mouthbass Micropterus salmoide

解剖各組大口黑鱸取其肝臟組織觀察發(fā)現(xiàn)，喂食配合飼料的大口黑鱸肝臟出現(xiàn)不同程度的病變，表現(xiàn)為肝臟腫大，色澤變淡，外表無光澤，嚴(yán)重的魚體內(nèi)脾已為黑褐色。飼養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)，喂食配合飼料的大口黑鱸食欲不振，游動(dòng)緩慢。

2.2 飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸肝臟中LPLtype1 mRNA、LPLtype2 mRNA表達(dá)量的影響

從圖1可見，大口黑鱸肝臟中LPLtype1 mRNA與LPLtype2 mRNA 的表達(dá)相似，均為喂食高脂肪含量的B 配合飼料組魚的肝臟中表達(dá)量最高，與喂食冰鮮雜魚和A 配合飼料的組存在顯著性差異(P＜0.05)(圖1)。

圖1 試驗(yàn)各組大口黑鱸肝臟中LPLtype1、LPLtype2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression levels of large mouth bass LPLtype1，and LPLtype2 mRNA in livers of large mouthbass Micropterus salmoide in the experiment

3 討論

本試驗(yàn)中，喂食冰鮮雜魚的對(duì)照組大口黑鱸的平均體質(zhì)量增加率明顯高于喂食兩種配合飼料的魚，且喂食配合飼料的大口黑鱸肝臟出現(xiàn)不同程度的病變，表現(xiàn)出食欲不振，游動(dòng)緩慢等現(xiàn)象，說明大口黑鱸這種肉食性養(yǎng)殖魚類對(duì)人工配合飼料還沒有形成很好的適應(yīng)性。關(guān)勝軍等［11］對(duì)大口黑鱸投喂人工配合軟飼料和冰鮮雜魚的生長對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果也表明，從投喂第20天開始，喂食冰鮮雜魚的大口黑鱸體質(zhì)量顯著高于喂食人工配合飼料的魚，與本研究結(jié)果相似。冰鮮雜魚中的粗脂肪含量占到了飼料干質(zhì)量的12.3%，但由于其中各種脂肪和蛋白質(zhì)所占的比例或其結(jié)合形式，易于被魚類所吸收，所以不影響肉食性魚類的健康生長。人工配合飼料雖然營養(yǎng)豐富，但與天然餌料相比其營養(yǎng)成分存在較大差異，而大口黑鱸對(duì)人工配合飼料還未形成很好的適應(yīng)性，所以人工配合飼料影響了魚體的健康生長，使其生長速度減慢。但也有學(xué)者認(rèn)為，人工配合飼料對(duì)肉食性水產(chǎn)動(dòng)物的生長沒有顯著影響［12-13］，這可能是由于養(yǎng)殖種類的不同，以及人工配合飼料適口性的差異和水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)人工配合飼料適應(yīng)性的差異造成試驗(yàn)結(jié)果的不同。

大口黑鱸脂蛋白脂肪酶LPLtype1和LPLtype2基因在喂食配合飼料與喂食冰鮮雜魚時(shí)相比，在肝臟出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，且在喂食脂肪含量最高的B配合飼料組大口黑鱸肝臟中表達(dá)量最高，與喂食冰鮮雜魚組和低脂肪飼料A 組有顯著性差異，說明本研究中的兩種人工配合飼料，特別是B 配合飼料中的脂肪含量已明顯高于大口黑鱸對(duì)脂肪的需求量，而魚體吸收的多余脂肪被貯存在魚類最主要的營養(yǎng)誘導(dǎo)性貯脂部位肝臟中，脂蛋白脂肪酶是脂肪代謝的關(guān)鍵酶，在分解肝臟內(nèi)多余的脂肪中起重要作用［14-15］，其表達(dá)受飼料中脂肪含量的調(diào)節(jié)。有研究表明，真鯛Pagrosomus major 的LPL 基因在肝臟也存在營養(yǎng)誘導(dǎo)性表達(dá)［16］，饑餓、高脂食物均是其表達(dá)誘導(dǎo)因子。楊奇慧等［17］也發(fā)現(xiàn)，喂食配合飼料的軍曹魚Rachycentron canadum 肝臟脂肪酶活性明顯比喂食冰鮮魚時(shí)高。Panserat等［18］采用cDNA Microarray 技術(shù)分析了用不同脂肪水平的飼料飼喂虹鱒Oncorhynchus mykiss 后其肝臟組織基因表達(dá)變化的情況，發(fā)現(xiàn)飼料脂肪水平誘導(dǎo)了虹蹲41 個(gè)肝臟基因的表達(dá)發(fā)生變化，其中包括脂蛋白脂肪酶基因的上調(diào)表達(dá)。

本試驗(yàn)中，喂食低脂肪和高脂肪配合飼料的試驗(yàn)魚肝臟中LPLtype1 mRNA表達(dá)量分別是對(duì)照組魚的1.3 倍和3.0 倍，而LPLtype2 mRNA表達(dá)量分別是對(duì)照組魚的1.7 倍和3.0 倍。這說明LPLtype1與LPLtype2 兩個(gè)基因具有相似的功能，且LPLtype2 基因?qū)︼暳现械闹竞扛鼮槊舾校资茱暳现懈咧竞康恼{(diào)節(jié)。氨基酸序列分析表明，大口黑鱸LPLtype1 與LPLtype2 之間的同源性為43.5%，LPLtype2 氨基酸序列比LPLtype1 少119個(gè)，主要表現(xiàn)為N 端部分序列缺失，但主要功能域仍保留著［4］。在大馬哈魚卵巢中也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)LPL 基因，分別被命名為LPL1和LPL2，其氨基酸同源性僅為31%，在卵巢中，LPL1 mRNA表達(dá)量在4月份出現(xiàn)一個(gè)明顯峰值，而LPL2 mRNA表達(dá)量在6月份出現(xiàn)一個(gè)明顯峰值，推測脂蛋白脂肪酶基因也調(diào)節(jié)著卵巢成熟的季節(jié)變化發(fā)育，并可能存在一定的功能分工［19］。

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