屠姍姍，夏 榮，吳先友

純鈦表面激光熔覆處理的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究

屠姍姍1，夏 榮1，吳先友2

目的探討激光熔覆后鈦表面多孔形貌對細(xì)胞黏附、增殖和分化的影響。方法在氬氣保護(hù)環(huán)境中應(yīng)用脈沖式摻釹釔鋁石榴石晶體（Nd：YAG）對45 μm鈦粉顆粒在鈦片表面進(jìn)行激光熔覆，采用場發(fā)射掃描電鏡（SEM）觀察鈦片表面微觀形貌，能量彌散X射線譜（EDS）檢測鈦片表面成分；采用小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞BMSCs體外培養(yǎng)評價(jià)噴砂酸蝕組（A組）和激光熔覆組（B組）的生物相容性。SEM觀察BMSCs在鈦表面的黏附狀況，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測法和堿性磷酸酶（AKP）活性檢測評價(jià)鈦片對BMSCs增殖和分化的影響。結(jié)果與A組比較，B組互相連通的多孔鈦表面更有利于BMSCs的黏附，也有利于BMSCs細(xì)胞的增殖和分化。結(jié)論激光熔覆處理鈦片表面可促進(jìn)BMSCs黏附、增殖及分化，有望成為一種有效有前景的鈦表面處理方法。

純鈦；激光熔覆；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；表面處理

種植體成功在很大程度上取決于植入后最初材料的機(jī)械穩(wěn)定性，以及隨后其與骨組織間強(qiáng)大的活性界面。鈦是目前最常見的種植體材料，擁有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，滿足材料的穩(wěn)定性，且給骨組織生長提供臨時的支撐，另一方面其具有良好的人體生物相容性，可與骨組織形成牢固的骨結(jié)合。種植牙是一種以植入骨組織內(nèi)的下部結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)來支持、固定上部牙修復(fù)體的缺牙修復(fù)方式，其安全性高、損傷小，應(yīng)用廣泛。為了提高種植的成功率，各種表面處理研究越來越多。表面處理是指用機(jī)械和化學(xué)等方法使種植體表面疏松、粗糙化，從而具有更好的生物黏附力和骨組織親和性，加快骨結(jié)合。相對于傳統(tǒng)表面處理方式，激光熔覆具有機(jī)械化的精確、高效等優(yōu)點(diǎn)，其為加法制作原理，較減法制作節(jié)省材料，已涉及人體內(nèi)研究［1］。該研究利用激光熔覆技術(shù)構(gòu)建鈦片表面微納米級多孔形貌，與傳統(tǒng)酸蝕噴砂技術(shù)進(jìn)行比較，探討鈦表面多孔形貌對小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）黏附、增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料和試劑 45 μm鈦粉（純度達(dá)為99.9%），直徑為10 mm、厚度為2 mm的純鈦片由陜西省寶雞銳誠鈦業(yè)有限公司提供；400 μm大顆粒氧化鋁粉由廣州莫秦有限公司提供；小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液由上海創(chuàng)始實(shí)業(yè)有限公司提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）由上海BestBio公司提供；堿性磷酸酶（AKP）檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所提供Nd：YAG脈沖激光器；中國科學(xué)院材料物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供場發(fā)射掃描電鏡（美國FEI公司sirion 200）；安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供CO2培養(yǎng)箱（德國heraeus）、倒置顯微鏡（OLYMPUS CKX41）、酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，ELx800）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 1000＃砂紙將直徑為10 mm、厚度為2 mm的鈦片表面拋光，依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲分別清洗30 min，45℃烤箱中烘干。

A組：噴砂酸蝕組，垂直光滑鈦片表面用400 μm大顆粒氧化鋁噴砂10 s，清洗后置于67%HCl／H2SO4（1∶1）中，在80℃下酸蝕10 min，再置于蒸餾水防氧化。

B組：激光熔覆組，選擇九水硅酸鈉做為粘結(jié)劑，將45 μm鈦粉均勻涂于干燥的鈦片上烘干，選擇電流110 A，峰值功率2.2 KW對上述預(yù)涂層鈦片進(jìn)行激光熔覆處理。將兩組鈦片依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲分別清洗30 min，烘干。

1.2.2 表面形態(tài)和成分 場發(fā)射掃描電鏡（sacnning electron microscopy，SEM）觀察鈦片表面微觀結(jié)構(gòu)，能量彌散X射線譜（energy dispersion spectros-

copy，EDS）檢測表面成分。

1.2.3 細(xì)胞黏附觀察 將兩組鈦片采用高壓蒸汽（200℃）滅菌后置于24孔培養(yǎng)板中，用胰酶消化第8代小鼠BMSCs，配制細(xì)胞懸液，以每孔4×104個細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況。每組9個鈦片，于24、48、72 h各取出3個，2.5%戊二醛固定2 h，PBS反復(fù)沖洗，自然風(fēng)干，噴金，SEM觀察鈦片表面細(xì)胞黏附、生長情況。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測 同1.2.3法接種細(xì)胞培養(yǎng)。每組16個鈦片，第1、3、5、7天時每組取出4個，置入24孔培養(yǎng)板，每孔加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測吸光度（OD）值。

1.2.5 細(xì)胞分化檢測 同1.2.3法接種細(xì)胞培養(yǎng)。每組12個鈦片，第3、5、7天時每組取出4個，置入24孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1%的Triton X-100，培養(yǎng)箱中孵育1 h，滴加AKP檢測試劑，37℃恒溫水浴15 min后加入顯色劑，酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測吸光度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 鈦表面觀察電鏡查看鈦表面形態(tài)，A組表面孔徑大小為0.5～3 μm，B組表面相互連通的三維孔洞直徑大小為100 nm～20 μm。見圖1。

2.2 表面成分分析EDS分析鈦表面成分，兩組表面除主要成分為鈦外，A組還含有噴金后存在的金（Au）元素，B組含少量硅和碳元素。見圖2。

圖1 兩組鈦表面形貌 SEM×5 000

圖2 兩組鈦表面能譜

2.3 細(xì)胞黏附觀察BMSCs生長24、72 h噴金后鈦片表面電鏡形貌，A組：粗糙表面細(xì)胞沿表面淺窩生長；B組：細(xì)胞沿表面孔洞生長，三維孔洞內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。見圖3、4。圖4 B1、B2中箭頭所示可見纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖3 BMSCs生長24 h后鈦片表面電鏡

圖4 BMSCs生長72 h后鈦片表面電鏡

2.4 細(xì)胞增殖檢測與A組比較，B組在第5、7天時OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

圖5 兩組鈦片細(xì)胞培養(yǎng)1、3、5、7 d時細(xì)胞增殖曲線

2.5 細(xì)胞分化檢測與A組比較，B組在第5、7天時OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖6。

3 討論

牙種植體，最終的目標(biāo)是獲得種植體和天然周圍骨之間的固定、結(jié)合和穩(wěn)定，此過程源自自身間充質(zhì)干細(xì)胞可以遷移到植入部位，增殖并分化為成熟的成骨細(xì)胞，并分泌胞外基質(zhì)形成骨結(jié)合。此過程與種植體表面形態(tài)有一定關(guān)系，諸多研究［2－3］顯示，機(jī)械光滑鈦表面細(xì)胞為平層結(jié)構(gòu)，主要為二維形態(tài)，而粗糙鈦表面細(xì)胞為多邊形態(tài)，三維形態(tài)的粗糙表面有更大的接觸面積，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、擴(kuò)散和分化，從而能促進(jìn)成骨細(xì)胞合成骨組織。

圖6 兩組鈦片細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7 d時細(xì)胞分化能力曲線

牙種植體成功與種植材料表面積大小直接相關(guān)，因此為了提高種植體成功率，增加骨結(jié)合率，產(chǎn)生了多種多樣的表面處理方式。經(jīng)典的處理方法是噴砂酸蝕，可構(gòu)造蜂窩狀結(jié)構(gòu)的粗糙表面，瑞士Stratmmnn公司推出的ITI牙種植體系統(tǒng)即是噴砂酸蝕表面處理，粗糙表面微孔直徑約2 μm，噴砂酸蝕種植體有可能存在殘余噴砂顆粒，對種植體有一定影響，另一方面鈦表面在噴砂過程中或噴砂酸蝕表面暴露于空氣中大于24 h，易被碳?xì)浠衔镂廴?，碳?xì)浠衔锓怄i了種植體表面活性羥基，降低了表面親水性，是影響鈦生物活性的一個因素，親水改性的粗糙鈦表面促進(jìn)牙種植體周圍骨結(jié)合［4－5］。本實(shí)驗(yàn)中，將噴砂酸蝕處理的鈦片保存在蒸餾水中可以防止噴砂酸蝕表面進(jìn)一步被污染［6］，而激光熔覆處理的鈦表面則穩(wěn)定性好，無需特殊保存。

瑞士ITI牙種植體與市場上銷售的巴西表面雙酸蝕刻種植體［7］構(gòu)造蜂窩狀結(jié)構(gòu)的粗糙表面有利于骨結(jié)合形成，而本實(shí)驗(yàn)鈦表面激光熔覆處理也構(gòu)造出相互連通的粗糙表面，三維孔洞直徑大小為100 nm～20 μm，直接設(shè)定各項(xiàng)激光參數(shù)還可調(diào)控三維孔洞直徑大小范圍，且不會形成表面雜質(zhì)［8］。

激光熔覆技術(shù)利用高能密度的激光束在原料粉末和金屬表面快速形成熔池又快速凝固，此過程增加了涂層與基體之間的結(jié)合強(qiáng)度，通過激光熔覆技術(shù)對鈦表面進(jìn)行改性，可以改善鈦表面的性能并增強(qiáng)其生物活性。激光快速成形技術(shù)將激光熔覆技術(shù)和快速成形技術(shù)結(jié)合起來，在很多領(lǐng)域，特別是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒌玫綇V泛的應(yīng)用。其原理是將計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的三維模型轉(zhuǎn)換為按一定厚度分層的二維輪

廓信息，再利用激光熔覆方法將金屬粉末逐層堆積，最終得到三維實(shí)體成品。

激光熔覆處理形成的微觀鈦表面為相互連通的開放多孔結(jié)構(gòu)，相對于酸蝕表面，可以為成骨細(xì)胞附著提供更積極的誘導(dǎo)作用。鈦表面增加了表面粗糙度，可能有助于集中更多的蛋白質(zhì)［9］，從而提高黏接強(qiáng)度；鈦表面的多孔結(jié)構(gòu)呈開放性，有利于引導(dǎo)成骨細(xì)胞向內(nèi)生長和附著，也容易引導(dǎo)血管長入，形成血管網(wǎng)又可為細(xì)胞提供更多營養(yǎng)；鈦表面的多孔結(jié)構(gòu)相互連通，不僅增加了表面接觸面積及后期成骨的機(jī)械鎖結(jié)力，還起到橋梁的作用，促進(jìn)細(xì)胞定位和體液傳輸；鈦表面孔洞結(jié)構(gòu)還易形成交錯的纖維蛋白網(wǎng)，纖維蛋白網(wǎng)可為細(xì)胞生長提供更多的引導(dǎo)和支撐，從而加快加強(qiáng)骨結(jié)合［10］。而酸蝕噴砂形成的孔洞非相互連通，孔洞深度有限。

牙種植體骨結(jié)合成功后還得承擔(dān)咀嚼力的傳導(dǎo)，激光熔覆產(chǎn)生的互連開放的多孔結(jié)構(gòu)有助于減少植入體表面的密度，從而減少應(yīng)力集中，實(shí)現(xiàn)長期協(xié)調(diào)穩(wěn)定［11］，該設(shè)計(jì)從機(jī)械的角度來看，孔隙率和孔的幾何形狀影響支架的機(jī)械性能和應(yīng)力疲勞，表面結(jié)構(gòu)的彈性模量，應(yīng)該是既有足夠的強(qiáng)度，以維持生理負(fù)荷，又不應(yīng)超過材料的剛度，防植入體的折裂。

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Study of titanium surface modified by laser cladding

Tu Shanshan1，Xia Rong1，Wu Xianyou2
（1Dept of Stomatology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Center of Medical Physics and Technology，Hefei Institutes of Physical Science，Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031）

ObjectivThis work focuses on the titanium surface with porous structure obtained by laser cladding and evaluation of cell adhesion，proliferation and differentiation.MethodsThe specimens were prepared by a pulsed Nd：YAG laser cladding of titanium powder with a particle size of 45 μm on it in an argon atmosphere.The microstructure and chemical composition analyses were performed by sacnning electron microscopy（SEM）and energy dispersion spectroscopy（EDS）.SEM，CCK-8 method and alkaline phosphatase activity assay were taken to evaluate the effect of the adhesion，proliferation and differentiation of mice bone marrow stem cells.ResultsThe titanium surface microstructure of multilevel and interconnected holes was proved of good cell biocompatibility.ConclusionLaser cladding proves to be an efficient means of surface modification of dental implants and the modified surface has a significant effect on the adhesion，proliferation and differentiation of BMSCs.

pure titanium；laser cladding；bone marrow stem cells；surface modification

R 783.1；TN 249；R 329.24

A

1000－1492（2014）11－1566－04

2014－06－27 接收

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號：KJ2009A037Z）；安徽省科技廳年度重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號：12070403070）；安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人科研活動經(jīng)費(fèi)資助（編號：2014H030）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，合肥 230601

2中國科學(xué)院醫(yī)學(xué)物理與技術(shù)中心，合肥 230031

屠姍姍，女，碩士研究生；

夏 榮，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xiarongqh＠aliyun.com