王小輝，王 萍，朱敏立，李月越，徐冰心，周金蓮，易 勇

N-乙酰半胱氨酸對模擬失重肺炎大鼠的保護性研究

王小輝1，王 萍1，朱敏立1，李月越1，徐冰心2，周金蓮3，易 勇4

目的探討在模擬失重（微重力）狀態(tài)下，N-乙酰半胱氨酸（NAC）對呼吸系統(tǒng)感染肺炎鏈球菌時的保護作用。方法將32只清潔級Wistar大鼠隨機均分為4組：尾吊灌藥注菌組（A組）、尾吊灌藥未注菌組（B組）、尾吊未灌藥注菌組（C組）、尾吊未灌藥未注菌組（D組）。從實驗第1天開始A、B組灌胃給予NAC 300 mg／kg，C、D組予以等量無菌注射用水灌胃。第2天采用國際通用的持續(xù)尾吊法建立模擬失重模型，A、C組于第4天通過氣管注入0.4 ml肺炎鏈球菌稀釋液。B、D組注入等量無菌生理鹽水。尾吊7 d后處死大鼠取材，測定血常規(guī)、中性粒細胞表面CD11b／c、中性粒細胞活性氧濃度、白介素-10（IL-10）、白介素-6（IL-6）含量。病理切片觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果C組顯微鏡下明顯可見肺泡大小不等，肺泡間隔增寬增厚，間質(zhì)內(nèi)大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見大量泡沫細胞。A組也可見上述病理變化，但較C組減輕，D組次之，B組病變最輕，炎癥反應(yīng)不明顯。A、C組白細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比高于B、D組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。A組與C組，B組與D組比較差異無統(tǒng)計學意義。各組間CD11b／c、中性粒細胞活性氧濃度、IL-10、IL-6含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)論N-乙酰半胱氨酸能夠減輕模擬失重狀態(tài)下大鼠肺炎鏈球菌肺炎的炎癥反應(yīng)和肺組織破壞，其抗氧化應(yīng)激作用可能對呼吸系統(tǒng)感染有一定保護作用。

失重模擬；大鼠；N-乙酰半胱氨酸；肺炎鏈球菌；肺部感染

隨著人類航天活動的增加，在軌飛行時間逐漸延長，失重狀態(tài)對人體各系統(tǒng)的影響逐漸引起重視。失重條件下，機體免疫功能下降。人類呼吸道常有多種微生物菌群寄居，在生存環(huán)境急劇變化或病理狀態(tài)下，如失重時下肢血液涌入低阻力、高順應(yīng)性、高流量的肺循環(huán)，使肺組織淤血，呼吸道與外界相通，各種致病菌、甚至條件致病菌可能繁殖，導致宿主更容易發(fā)生呼吸道感染性疾病。該研究旨在建立失重環(huán)境下肺炎鏈球菌肺炎的動物模型，并給與N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）抗氧化、應(yīng)激干預，觀察其對失重時肺感染是否有保護作用，為未來航天醫(yī)學研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組健康清潔級雄性Wistar大鼠32只由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，體重（270±20）g，按照隨機數(shù)字表法分為注藥組：尾吊灌藥注菌組（A組，n＝8）、尾吊灌藥未注菌組（B組，n＝8）、尾吊未灌藥注菌組（C組，n＝8）、尾吊未灌藥未注菌組（D組，n＝8）。

1.2 尾吊大鼠肺部感染模型的建立實驗第1天稱重，A、B組每天給予NAC 300 mg／（kg·d）灌胃［1］，C、D組每天注射用無菌用水1 ml等量灌胃。實驗第2天按照文獻［2］方法建立尾吊大鼠模型：每個鼠籠內(nèi)尾吊1只大鼠，使大鼠前肢踏于籠底，尾部懸于籠頂，后肢懸空完全解除負荷，身體縱軸與水平面約成30°。實驗環(huán)境為室溫（22℃），晝夜周期均為12 h，實驗過程中所有大鼠可以自由進食、飲水。A、C組于實驗第5天開始采用張均田［3］的氣管插管法經(jīng)氣管注入0.4 ml菌懸液（細菌濃度為9.0× 108CFU／ml）［4］，具體方法：用2%戊巴比妥鈉按60 mg／kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后將大鼠仰臥固定于實驗臺，并使實驗臺（大鼠頭部）與水平面保持約30°，用自制開口器將大鼠口腔撐開，充分暴露咽喉部，采用自制直徑約1 mm的金屬鈍針管經(jīng)口緩慢插入氣管后，用微量注射器緩慢注入菌液0.4 ml，立即將實驗臺垂直豎立保持1 min，使氣管內(nèi)菌液由于重力作用流入大鼠的支氣管和肺泡內(nèi)；B、D組在同一時間、同樣方法注入等量的生理鹽水。第8天處死實驗大鼠，并進行取材、病理檢查及細菌學鑒定，確定肺炎模型制備成功。

1.3 主要材料與試劑肺炎鏈球菌（ATCC6303，上海市米寶萊科技有限公司），按照說明書將細菌復蘇后配成所需濃度待用。Anti-Rat CD11b／c PE、抗大鼠粒細胞抗體（anti-rat granulocyte marker FITC，

美國eBioscience公司），大鼠白介素-10（interleukin-10，IL-10）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）。大鼠中性粒細胞分離液試劑盒（天津灝洋生物制品科技有限公司）?；钚匝鯔z測試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.4 方法

1.4.1 血常規(guī)、中性粒細胞及全血標本的處理 尾吊第8天時取材，上述方法麻醉后經(jīng)腹中動脈取血，6 h內(nèi)上機檢測血常規(guī)。取2 ml全血于生化管中，3 500 r／min離心5 min，取血清于－80℃冰箱保存，統(tǒng)一測定IL-10、IL-6含量。

1.4.2 中性粒細胞CD11b／c流式細胞儀檢測 大鼠外周血中性粒細胞的分離：參照大鼠中性粒細胞分離液說明書，取大鼠新鮮抗凝血1 ml，與全血及組織稀釋液1∶1混勻后小心加于1 ml分離液之液面上，以2 000 r／min（半徑15 cm水平轉(zhuǎn)子）離心30 min，此時離心管中由上至下細胞分為4層。第1層：血漿層；第2層：單核細胞層；第3層：富集一定中性粒細胞的分離液層；第4層：紅細胞層（含有一定中性粒細胞）。收集第3層和第4層，放入盛有2 ml細胞洗滌液的試管中，充分混勻后，以2 000 r／min離心30 min，棄去上清液，加入6～10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min，以2 000 r／min離心5 min，棄去紅色上清液，加入適量PBS溶液，重懸沉淀，2 000 r／min離心5 min，重復1次。分離率為80%以上。1 ml PBS溶液配成中性粒細胞懸液，取500 μl的中性粒細胞懸液，加入1 μl抗大鼠粒細胞抗體，5 μl anti-rat CD11b／c PE充分混勻，室溫避光20 min，于中性粒細胞段開窗，測定CD11b／c熒光強度（meanfluorescence intensity，MFI）。同時對各標本作陰性對照，除以等量同IgGFITC抗體代替CD11b／c-FITC抗體，每個樣本檢測10 000個細胞。

1.4.3 中性粒細胞活性氧（ROS）的檢測 采用雙乙酰基二氯熒光素（DCFH-DA），DCFH-DA沒有熒光，進入細胞后被酯酶水解為DCFH。在ROS存在時，DCFH被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質(zhì)（DCF），其熒光在激發(fā)波長502 nm、發(fā)射波長530 nm附近有最大波峰，強度與細胞內(nèi)活性氧水平成正比。首先將DCFH-DA工作濃度調(diào)整為20 μmol／L備用。取剩余500 μl的中性粒細胞懸液室溫2 000 r／min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml配好的DCFH-DA避光37℃水浴40 min。室溫2 000 r／min離心5 min，棄去上清液，用PBS洗滌2次后重懸，配成500 μl的細胞懸液，將流式細胞儀按激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長530 nm調(diào)好后進行檢測。

1.4.4 肺組織病理學檢查 尾吊第8天取材，每組均取右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定，切片行HE染色，光學顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，所有數(shù)據(jù)以±s表示，各組之間對比采用單因素方差分析，分析前均進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)性和方差齊性則選擇方差分析。若不符合，則行l(wèi)og轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)后進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)性和方差齊性行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理結(jié)構(gòu)改變C組病變最嚴重，顯微鏡下可見肺泡大小不一致，肺泡間隔增寬增厚，大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見大量泡沫細胞。A組次之，顯微鏡下可見肺泡大小不一致，肺泡間隔增寬增厚，間質(zhì)內(nèi)較多中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，局部肺泡腔滿泡沫細胞。B組顯微鏡下可見肺泡大小較一致，肺泡間隔增厚，間質(zhì)內(nèi)可見少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。D組肺泡大小不一致，肺泡間隔增寬，間質(zhì)內(nèi)少量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，肺淤血為著。見圖1。

圖1 各組肺組織病理學結(jié)果HE×200

2.2 流式細胞儀測定中性粒細胞CD11b／c取已配好的500 μl中性粒細胞懸液行流式細胞儀檢測，設(shè)粒細胞門見圖2、3；于中性粒細胞段開窗，測定CD11b／c熒光強度見圖4。

圖2 中性粒細胞前向角／側(cè)向角散點圖

圖3 加入抗大鼠粒細胞抗體散點圖

圖4 中性粒細胞CD11b／c熒光強度圖

圖5 中性粒細胞前向角／側(cè)向角散點圖

圖6 中性粒細胞內(nèi)ROS熒光強度圖

2.3 流式細胞儀測定中性粒細胞ROS熒光強度已配好的500 μl中性粒細胞懸液行流式細胞儀檢測設(shè)粒細胞門見圖5，將流式細胞儀按激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長530 nm調(diào)好后，進行檢測粒細胞內(nèi)ROS熒光強度見圖6。

2.4 血常規(guī)指標變化A、C組白細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比高于B、D組，差異有統(tǒng)計學意義（F＝13.80、95.41、36.55，P＜0.01）。A組與C組、B組與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 外周血白細胞及中性粒細胞總數(shù)的比較（n＝8，±s）

表1 外周血白細胞及中性粒細胞總數(shù)的比較（n＝8，±s）

與B組比較：**P＜0.01；與D組比較：＃＃P＜0.01

組別白細胞總數(shù)（×109／L）中性粒細胞總數(shù)（×109／L）中性粒細胞百分比A8.85±0.43**＃＃2.77±0.15**＃＃0.30±0.01**＃＃B8.21±0.252.11±0.110.25±0.01 C9.29±0.64**＃＃2.89±0.16**＃＃0.31±0.02**＃＃D8.09±0.262.01±0.080.24±0.01

2.5 血中性粒細胞CD11b／c、ROS的變化各組間CD11b／c、ROS比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝246.69、136.98，P＜0.01）。見表2。

2.6 IL-10、IL-6的變化各組間IL-10、IL-6比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝114.51、486.25，P＜0.05）。見表3。

表2 大鼠中性粒細胞CD11b／c、ROS量的變化（n＝8，±s）

表2 大鼠中性粒細胞CD11b／c、ROS量的變化（n＝8，±s）

項目A組B組C組D組P值CD11b／c137.06±4.45128.54±2.52160.94±4.49113.11±2.34＜0.01 ROS1 609.46±140.421 044.40±55.982 114.04±179.271 155.04±93.38＜0.01

表3 大鼠血清IL-10、IL-6指標變化（n＝8，pg／ml，±s）

表3 大鼠血清IL-10、IL-6指標變化（n＝8，pg／ml，±s）

項目A組B組C組D組P值IL-104.39±0.2453.60±0.135.91±0.484.05±0.17＜0.05 IL-632.46±3.17512.31±0.9039.83±2.2018.50±0.61＜0.05

3 討論

呼吸系統(tǒng)與外界直接相通，人類上呼吸道寄生著大量細菌，由于人體免疫系統(tǒng)的調(diào)控，寄生菌和人體處于“和平相處”狀態(tài)［5］。研究［6］證明在失重或微重力狀態(tài)時，機體的免疫系統(tǒng)功能降低；而細菌毒力增加，耐藥性增強［7］，這種平衡被打破，機體易于發(fā)生呼吸道感染。感染時中性粒細胞募集于肺部，在參與殺死細菌的同時，由于過量募集也會導致放大炎癥反應(yīng)和加重組織損傷。本課題組前期研究［4］顯示，模擬失重狀態(tài)下，機體的炎癥反應(yīng)增強、組織損傷較對照組明顯。NAC為谷胱甘肽（GSH）的前體物質(zhì)，研究［8－10］證實它具有較強的還原性，能夠有效減少活性氧，抑制炎癥反應(yīng)，保護細胞免受損傷，并能減少肺炎鏈球菌在口咽部上皮細胞的黏附［11］。肺炎鏈球菌是最常見社區(qū)獲得性呼吸道感染的致病菌，本研究選用NAC的抗氧化、應(yīng)激作用干預失重疊加肺炎鏈球菌感染動物模型，結(jié)果顯示，失重并注菌組與對照組比較，肺組織損傷嚴重，間質(zhì)內(nèi)大量中性粒細胞浸潤。注藥組的肺組織損傷有所減輕，間質(zhì)內(nèi)中性粒細胞明顯減少。提示NAC可能減少中性粒細胞在肺臟的募集，有效減輕炎癥反應(yīng)，降低組織傷害。

成熟粒細胞的CD11b主要儲存在胞質(zhì)內(nèi)，當受到炎癥刺激時，CD11b表達上調(diào)并轉(zhuǎn)移到細胞膜表面，介導粒細胞向炎癥部位趨化，釋放有害物質(zhì)，導致組織損害［12］。本研究結(jié)果顯示，NAC干預組CD11b較對照組降低，證實NAC能減少CD11b在中性粒細胞表面的表達，從而減少粒細胞在肺內(nèi)募集，減輕炎癥反應(yīng)和肺損傷。

研究［13］表明中性粒細胞激活時產(chǎn)生的活性氧，能殺滅細菌，但過量時可造成正常組織的損害。本研究中C組ROS熒光強度高于其他組，表明中性粒細胞呼吸氧爆發(fā)產(chǎn)生過量ROS，炎癥反應(yīng)更嚴重，與肺組織病理結(jié)構(gòu)變化一致。而A組ROS熒光強度明顯降低，說明NAC能降低中性粒細胞內(nèi)ROS濃度，減輕了ROS炎癥反應(yīng)對肺組織的損害。同時觀察到B、D組ROS熒光強度也降低，提示NAC對失重狀態(tài)下的肺組織也具有保護作用。

IL-10是由Th2等細胞分泌的，是一種具有多種生物學功能的抑制炎癥因子，與炎癥程度呈正相關(guān)［14］。本研究顯示，A組IL-10水平較C組低，提示IL-10可能參與NAC對肺組織的保護機制。IL-6是一種主要來源于受刺激的單核巨噬細胞的促炎因子［15］。本研究結(jié)果顯示C組IL-6水平高于A組，病理證實該組肺部炎癥最重，支持NAC有減輕炎癥反應(yīng)，保護肺組織的作用。

綜上所述，NAC能夠減輕微重力狀態(tài)下肺炎鏈球菌肺炎的炎癥反應(yīng)，提高機體抗感染能力，有效保護肺組織。為航天醫(yī)療保障提供了科學實驗數(shù)據(jù)，為呼吸系統(tǒng)炎癥損傷及感染的防護和治療提供參考依據(jù)。

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The protective effect of N-acetylcysteine onstreptococcus pneumonia model of simulated weightlessness rats

Wang Xiaohui，Wang Ping，Zhu Minli，et al
（Dept of Respiratory and Critical Care Medicine，The 306th Hospital of PLA，Anhui Medical University，Beijing 100000）

ObjectivTo explore the ability of resistance to the infection of Streptococcus pneumoniae of the body during simulated weightlessness，which was set up through tail suspension.Besides this，the protective role of N-acetylcysteine was also observed.MethodsThe simulated microgravity and infected animal model：Healthy clean male Wistar rats（n＝32），weight（270±20）g，randomly divided into 4 groups：Group A（tail suspension，infection and NAC group），Group B（tail suspension，NAC and no infection group），Group C（tail suspension，infection and no NAC group），Group D（tail suspension，no infection and no NAC group）.NAC［300 mg（kg· d）］were fed by intragastric administration on the first day，while the same amount of distilled water were fed in control group.On the second day，the models of simulated weightlessness were duplicated by tail suspension method（Each rat was hung by its tail in a cage，and 30 degrees with the horizontal）.The rats were intratracheal instilled with 0.4 ml suspension of streptococcus pneumoniae after tail-suspension for 3 days.At the same time，noinfection groups were intratracheal instilled with 0.4 ml sterile saline.At the end of experiment，the rats were killed.The leukocytes and neutrophils，CD11b and DCFH-DA in the blood were studied.Results①The pathological changes of rat lung：in Group C，obvious congestion of the lung tissue could be observed.Some of alveolus got fusion，alveolar septum got sick，lung’s small veins and capillaries dilated and congestion.Large number of neutrophils and lymphocytes infiltrated in the interstitial，foam cells flooded in the alveolar space.Some changes like these could be found in Group A，but less severe than Group C.A few of the same changes but less severe could be observed in Group D.②Compared with Group A and Group C，the percentage of neutrophile was significantly higher than that in Group B and Group D.And the same trend could be observed in leukocyte count and neutrophile count.There was a statistically significant difference of the mean value of CD11b among four groups，and the value was the highest in Group C.The same trend was observed in DCFH-DA，IL-10 and IL-6.ConclusionOnce the lung was insulted by bacterial during weightlessness，the inflammatory response was significantly higher，the pathological changes were much more severe.NAC would alleviate these changes.The antioxidation effect of NAC may play a role in protection of lung infection while in weightlessness.

simulated weightlessness；rat；N-acetylcysteine；Streptococcus pneumoniae；pulmonary infection

R 332

A

1000－1492（2014）11－1544－05

2014－08－11 接收

全軍醫(yī)學科學技術(shù)研究“十二五”重點項目（編號：BWS11J051）

安徽醫(yī)科大學解放軍第306醫(yī)院臨床學院1呼吸與重癥醫(yī)學科、2特種病科、3病理科、4微生物室，北京 100000

王小輝，男，碩士研究生；

王 萍，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：pingwang306hpbj＠163.com