余建國(guó) 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院浙江金華 321007

復(fù)方紫花地丁對(duì)鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除作用

余建國(guó) 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院浙江金華 321007

以復(fù)方紫花地丁制劑為消除劑、十二烷基硫酸鈉為對(duì)照組消除劑，以鴨大腸桿菌耐藥菌株為靶細(xì)菌，進(jìn)行耐藥質(zhì)粒體外消除試驗(yàn)，通過質(zhì)粒DNA抽提及瓊脂糖凝膠電泳方法，觀察紫花地丁注射液對(duì)該耐藥菌株質(zhì)粒的影響。結(jié)果提示：復(fù)方紫花地丁制劑對(duì)耐藥鴨大腸桿菌作用24 h，其1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的消除率分別為6.9%、8.6%、10.2%；延長(zhǎng)作用時(shí)間至48 h，其1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的消除率分別為7.1%、8.9%、11.3%。結(jié)果表明：復(fù)方紫花地丁制劑對(duì)鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒有消除作用。在一定濃度范圍內(nèi)，劑量與功效呈反比。

復(fù)方紫花地丁 耐藥質(zhì)粒 鴨大腸桿菌 消除

鴨致病性大腸桿菌（duck pathogenic Escherichia coli）是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最重要的病原之一。由于抗菌類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用，導(dǎo)致大腸桿菌存在廣泛的耐藥性。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，根據(jù)耐藥狀況，細(xì)菌耐藥分為兩類：第一類，即單一耐藥因素，細(xì)菌對(duì)一類抗菌藥物的所有種類都耐藥；第二類，多重耐藥性，因質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的耐藥因素，使細(xì)菌對(duì)多類抗菌藥物耐藥[1]。

目前，致病性大腸桿菌耐藥性的解決途徑主要有以下幾種：一是減少抗菌藥物的使用并保護(hù)現(xiàn)有藥物。二是開發(fā)膜通透性較好的藥品，使藥物的內(nèi)流速度大于外排；此外，研制大腸桿菌多重耐藥的抑制劑及替代產(chǎn)品等工作也在進(jìn)行中。解決耐藥性問題是一項(xiàng)復(fù)雜、持續(xù)而艱巨的任務(wù)，且部分工作耗資巨大，按照我國(guó)的現(xiàn)狀，這項(xiàng)工作依然任重道遠(yuǎn)。將耐藥質(zhì)粒從宿主菌中消除，使其恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性，是臨床治療多重耐藥菌感染的新思路。

國(guó)內(nèi)外有人利用理化因素和中藥對(duì)耐藥質(zhì)粒進(jìn)行消除，質(zhì)粒消除后細(xì)菌的耐藥性也隨之喪失，并且不再恢復(fù)，但理化因素對(duì)機(jī)體毒副作用較大，而中草藥由于毒副作用小、價(jià)格便宜及體內(nèi)使用安全而備受重視[2]。中藥制劑的開發(fā)和研究是諸多途徑中逐漸引起學(xué)者重視的一種，藥理學(xué)研究提示：部分中藥及其提取物可以減弱甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性。已經(jīng)證實(shí)有抗菌作用的中藥黃芩、黃連、金銀花、三黃片等也能降低細(xì)菌的耐藥性。一般認(rèn)為中藥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的機(jī)制，包括R質(zhì)粒的消除作用；抑制藥物的主動(dòng)外排泵、抑制β內(nèi)酰胺酶活性等[3]。

紫花地?。℉erba Violae）為堇菜科（Violaceae）植物紫花地?。╒iola yedoensis Makino）的干燥全草。藥理作用學(xué)研究提示：紫花地丁中所含內(nèi)酯具有抗炎及體外抑菌作用[4-5]。

本試驗(yàn)究按照祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中君丞佐使的配伍原則，以紫花地丁為主，輔以金銀花、野菊花、蒲公英等，按一定比例配制成復(fù)方紫花地丁制劑。并選取該制劑作為消除劑，對(duì)鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒進(jìn)行體外消除試驗(yàn)，研究復(fù)方紫花地丁制劑對(duì)耐藥質(zhì)粒的消除作用，為臨床上有效治療鴨大腸桿菌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑復(fù)方紫花地丁制劑，由紫花地丁、金銀花等藥物制備，含生藥1 g/mL，自制。十二烷基硫酸鈉（SDS）：購(gòu)于上海市化工試劑廠，批號(hào)20130822。藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基Chapman's培養(yǎng)基：含蛋白胨10 g/ L、牛肉膏1 g/L、氯化鈉75 g/L、瓊脂18 g/L、甘露醇10 g/L、1 g/L酚紅溶液25 mL，pH7.4。麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂及瓊脂粉等，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 菌株鴨源性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株K88，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，質(zhì)控對(duì)照菌株ATCC29213購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

耐藥菌的誘導(dǎo)：取過夜生長(zhǎng)的敏感細(xì)菌K88培養(yǎng)液0.1 mL，涂于含1/2 MIC恩諾沙星的普通瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16～18 h，挑取平皿上的單個(gè)菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)過夜，次日取0.1 mL的培養(yǎng)液涂于含1MIC恩諾沙星的普通瓊脂平板上，重復(fù)上述過程并不斷增加平皿中恩諾沙星的濃度，直至細(xì)菌的MIC值提高至≥8.0 ug/mL。測(cè)定所得菌株的MIC，并經(jīng)過三次平皿傳代培養(yǎng)，證實(shí)為非適應(yīng)性生長(zhǎng)后保存?zhèn)溆?，將該菌編為K881。

1.2 耐藥性消除試驗(yàn)

1.2.1 質(zhì)粒體外消除試驗(yàn)試驗(yàn)組：將K881菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)過夜，再接種于Chapman's培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，挑取瓊脂表面生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，混懸于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌液濃度到1×106CFU/mL，備用[6]。取100 μL菌液分別加入含不同濃度中藥制劑的培養(yǎng)基中（制劑起始濃度為1 g/mL，依次二倍稀釋至第7管，第8管不加藥物作為菌液對(duì)照，第9管不加菌液作藥物對(duì)照，第10管只加肉湯作空白對(duì)照），每管液體培養(yǎng)基總量1 mL。

37℃培養(yǎng)24 h和48 h，判定亞抑菌濃度。分別取24 h和48 h的1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的3管菌液100 μL進(jìn)行稀釋，接種Chapman's培養(yǎng)基，涂勻后37℃培養(yǎng)24～48 h，取50 mL培養(yǎng)物劃線接種于普通平板，37℃培養(yǎng)16～18 h。待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，用滅菌牙簽挑取500個(gè)菌落，以影印培養(yǎng)法，對(duì)應(yīng)點(diǎn)種于含恩諾沙星藥物不同濃度平板上和不含藥物的普通平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

對(duì)照組：取K881菌液20 uL，接種于含亞抑濃度消除劑（SDS，亞抑菌濃度根據(jù)文獻(xiàn)為100 ug/mL）的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24～48 h，取50 mL培養(yǎng)物劃線接種于普通平板，37℃培養(yǎng)16～18 h。取50 mL培養(yǎng)物劃線接種于普通平板，37℃培養(yǎng)16～18 h。待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，用滅菌牙簽挑取500個(gè)菌落，以影印培養(yǎng)法，對(duì)應(yīng)點(diǎn)種于含恩諾沙星藥物不同濃度的平板上和不含藥物的普通平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。進(jìn)行2次重復(fù)性試驗(yàn)。

1.2.2 消除子的篩選與鑒定挑取在含抗菌藥物的選擇平板上不生長(zhǎng)，而在不含藥物的普通平板上生長(zhǎng)的菌落，在普通培養(yǎng)基上傳代后，再在含藥平板上進(jìn)行復(fù)測(cè)后證實(shí)，即為質(zhì)粒消除子，并檢查其菌落、菌形及染色特征[6]。

根據(jù)耐藥性消除菌落數(shù)與檢測(cè)菌落總數(shù)之比，計(jì)算測(cè)試菌耐藥性消除率。將搜集到的消除子與原菌液同時(shí)按文獻(xiàn)[7]改進(jìn)堿裂解法進(jìn)行快速質(zhì)粒DNA抽提，瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)質(zhì)粒帶的消失情況。將試驗(yàn)組與對(duì)照組所得菌株的耐藥性消除率應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0進(jìn)行x2檢驗(yàn)，以比較差異性。

2 結(jié)果與分析

1）用復(fù)方紫花地丁制劑作用耐藥鴨大腸桿菌24 h、48 h（1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC）后，其消除結(jié)果與SDS對(duì)照組比較，均有極顯著差異（P<0.01）。表明復(fù)方紫花地制劑在體外，具有消除鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的作用，并且消除效果顯著高于SDS對(duì)照組。用不同濃度復(fù)方紫花地丁制劑作用耐藥鴨大腸桿菌，其消除結(jié)果與對(duì)照組均有顯著性差異（P< 0.05），表明不同濃度的復(fù)方紫花地丁制劑對(duì)鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒有明顯的影響，在一定濃度范圍內(nèi)，劑量與功效呈反比。

2）同一濃度復(fù)方紫花地丁制劑在不同時(shí)間作用耐藥鴨大腸桿菌，其消除結(jié)果無顯著性差異（P> 0.05），表明不同作用時(shí)間對(duì)鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除沒有影響（試驗(yàn)結(jié)果見表1-表2）。

表1 不同濃度復(fù)方紫花地丁制劑作用24 h對(duì)鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除率

表2 不同濃度復(fù)方紫花地丁制劑作用48 h對(duì)鴨大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除率

3）消除子質(zhì)粒的檢測(cè)。原始株與消除子經(jīng)改進(jìn)堿裂解法快速抽提質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察發(fā)現(xiàn)，消除子均丟失1～2條質(zhì)粒帶，表明在復(fù)方紫花地丁制劑作用下，鴨大腸桿菌菌質(zhì)粒被消除。結(jié)果見圖1-圖2。

圖1 復(fù)方紫花地丁制劑作用24 h對(duì)鴨大腸桿菌質(zhì)粒消除的電泳圖譜（M:DNA標(biāo)準(zhǔn)，1:1/2MIC消除菌株，2：1/:4MIC消除菌株，3：1/8MIC消除菌株，4：耐藥菌株）

圖2 復(fù)方紫花地丁制劑作用48 h對(duì)鴨大腸桿菌質(zhì)粒消除的電泳圖譜（M:DNA標(biāo)準(zhǔn)，1:1/2MIC消除菌株，2：1/:4MIC消除菌株，3：1/8MIC消除菌株，4：耐藥菌株）

3 討論

1）陳群等用中藥黃芩與止痢靈對(duì)重耐藥性大腸桿菌E10株進(jìn)行了體外R質(zhì)粒消除試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與單一中藥比較，聯(lián)合用藥可以顯著提高消除效果[7]。本試驗(yàn)選用的復(fù)方紫花地丁制劑為對(duì)鴨大腸桿菌制作用的制劑，MIC為120 mg/mL，故選其作為質(zhì)粒消除劑。結(jié)果提示：一定濃度復(fù)方紫花地丁液對(duì)鴨大腸桿菌的耐藥質(zhì)粒具有良好的體外消除作用，效果顯著優(yōu)于SDS。此外，復(fù)方紫花地丁液還表現(xiàn)出對(duì)多重耐藥性的消除作用。

2）隨著復(fù)方紫花地丁制劑濃度的減小，其對(duì)耐藥鴨大腸桿菌的耐藥質(zhì)粒消除率上升，并且有顯著性差異。進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)后仍呈現(xiàn)此規(guī)律。24 h和48 h的消除率隨時(shí)間的延長(zhǎng)有所提高，但沒有顯著性差異。表明在一定濃度范圍內(nèi)，劑量與功效呈反比；作用時(shí)間對(duì)其質(zhì)粒消除效果沒有顯著的影響。這與陳群等的結(jié)果呈現(xiàn)不一致，可能與中藥抑制試驗(yàn)尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

3）有中藥質(zhì)粒消除試驗(yàn)證明，質(zhì)粒條帶沒有消除的菌株，其抑菌圈仍有擴(kuò)大。推測(cè)可能是因?yàn)椴糠譀Q定耐藥基因被消除，導(dǎo)致堿基數(shù)量減少，在凝膠電泳上不能將它們區(qū)分?；蛘咧苿┳饔煤缶w內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，使一些耐藥片段發(fā)生突變，成為“沉默基因”，關(guān)于此現(xiàn)象，將在后續(xù)試驗(yàn)中加以證實(shí)[8]。

4）中藥制劑雖然一定程度發(fā)揮了耐藥消除作用，但作用緩慢。這可能與其有效成分含量低有關(guān)。在今后的實(shí)踐中，應(yīng)用現(xiàn)代中藥提取、分析、精制技術(shù)，開發(fā)抑制細(xì)菌耐藥性的純天然高活性抑制劑是比較理想的方向。此外，用于耐藥性消除的中藥本身都具有一定的抗菌效果，其抗菌能力的強(qiáng)弱與逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性之間是否相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

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Mination effcect of complex prescription Herba Violae antibiotic resistant plasmid of duck pathogenic Escherichia coli

Yu Jianguo
(Faculty of Bioengineering,Jinhua Polytechnic,Zhejiang 321007)

The multidrug resistant plasmid from the strain of complex prescription Herba Violae agent,which was isolated from the duck with pathogenic Escherichia coli,was extracted and the elimination test was performed in vitro with sodium dodecyl sulp hate as negative control.The effect of the complex prescription Herba Violae agent prescription dandelion's injection or the plasmid elimination was detected by plasmid DNA extraction and agarose gel electrophoresis,and the feasibility of the complex prescription Herba Violae agent was discussed as elimination reagent.In result,the elimination rate of resistant plasmid of 1/2,1/4 and 1/8 MIC was 6.9%, 8.6%and 10.2%respectively after t reatment of the prescription Herba Violae agent for 24 h.The elimination rate of resistant plasmid of 1/2,1/4 and 1/8 MIC was 7.1%,8.9%and 11.3%respectively at 48 h.These results showed that the elimination effect of t he complex prescription Herba Violae agent was clearly and high feasibility for clinic use.

complex prescription Herba Violae antibiotiresistant plasmid duck pathogenic Escherichia coli elimination

A

1003-4331（2014）06-0032-03