吳蔚 詹文輝 李鶴 應(yīng)清香 廖媛 王邦彥 福建省南平市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 353000

不同方法提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA效果的比較分析

吳蔚 詹文輝 李鶴 應(yīng)清香 廖媛 王邦彥 福建省南平市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 353000

高致病性禽流感以及新城疫對(duì)禽養(yǎng)殖戶(hù)危害巨大，應(yīng)用熒光RT-PCR方法對(duì)高致病性禽流感、新城疫病毒進(jìn)行檢測(cè)在病原學(xué)檢測(cè)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。而熒光RT-PCR檢測(cè)的核心是核酸物質(zhì)的提取。本文將離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取法（柱膜法）與磁珠法作比較，探討更適合基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的核酸提取方式。

柱膜法 磁珠法 提取 比較

高致病性禽流感（以禽流感H5、H7為代表）及新城疫對(duì)禽養(yǎng)殖戶(hù)危害巨大，均屬于我國(guó)規(guī)定的一類(lèi)動(dòng)物疫病。RT-PCR方法結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)[1]，通過(guò)熒光信號(hào)的變化檢測(cè)高致病性禽流感及新城疫病毒RNA，為我國(guó)目前較為準(zhǔn)確的檢測(cè)手段。而提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA有多種方法[2]，離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取法（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“柱膜法”）與磁珠法是各種方法中的佼佼者，本文將這兩種方法作比較，闡述如下。

1 材料與方法

1.1 樣本與試劑樣本分別為禽流感H5、H7及新城疫陽(yáng)性、陰性對(duì)照品（深圳凱杰生物工程有限公司）。柱膜法采用凱杰生物的試劑盒，磁珠法采用天隆科技的試劑盒。

1.2 儀器微量可調(diào)節(jié)移液器、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、核酸提取儀NP968型（西安天隆科技有限公司）、PCR熒光檢測(cè)儀（凱杰生物工程有限公司）。

1.3 方法

1）以禽流感H5為例：將禽流感H5陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品分為兩組，一組用柱膜法提取RNA，另一組用磁珠法提取RNA。柱膜法的提取過(guò)程為：化學(xué)裂解-過(guò)柱吸附-洗滌-洗脫，全程人工提取，在生物安全柜內(nèi)操作。磁珠法的提取過(guò)程為：化學(xué)裂解-加磁珠吸附-洗滌-洗脫，由核酸提取儀半自動(dòng)操作。樣本分別經(jīng)過(guò)柱膜法和磁珠法處理后，提取的產(chǎn)物（洗脫產(chǎn)物）均加入擴(kuò)增試劑（RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶、Taq酶），分裝，放入PCR熒光檢測(cè)儀內(nèi)設(shè)置好循環(huán)條件同時(shí)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)完成后根據(jù)樣本Ct值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。

2）禽流感H7和新城疫的RNA提取過(guò)程同禽流感H5，檢測(cè)樣本換成禽流感H7及新城疫陽(yáng)性、陰性對(duì)照品。

2 結(jié)果

高致病性禽流感、新城疫病毒熒光RT-PCR的結(jié)果分別見(jiàn)圖1-圖3。

2.1 兩種方法提取禽流感病毒H5的比較柱膜法提取的陽(yáng)性對(duì)照品（1號(hào)線）的Ct值為17.43，磁珠法提取的陽(yáng)性對(duì)照品（2號(hào)線）的Ct值為14.42，柱膜法和磁珠法分別提取的陰性對(duì)照品（3、4號(hào)線）的Ct值均為none。見(jiàn)圖1。

圖1 兩種方法提取禽流感H5病毒RNA效果的比較

2.2 兩種方法提取禽流感病毒H7的比較柱膜法提取的陽(yáng)性對(duì)照品（1號(hào)線）的Ct值為18.75，磁珠法提取的陽(yáng)性對(duì)照品（2號(hào)線）的Ct值為15.14，柱膜法和磁珠法分別提取的陰性對(duì)照品（3、4號(hào)線）的Ct值均為none。見(jiàn)圖2。

圖2 兩種方法提取禽流感H7病毒RNA效果的比較

2.3 兩種方法提取新城疫病毒的比較柱膜法提取的陽(yáng)性對(duì)照品（1號(hào)線）的Ct值為14.00，磁珠法提取的陽(yáng)性對(duì)照品（2號(hào)線）的Ct值為11.45，柱膜法和磁珠法分別提取的陰性對(duì)照品（3、4號(hào)線）的Ct值均為none。見(jiàn)圖3。

3 分析與討論

1）結(jié)果表明，無(wú)論是柱膜法還是磁珠法，均對(duì)高致病性禽流感及新城疫病毒RNA有較好的提取效果。因?yàn)閳D1-圖3所示的陽(yáng)性對(duì)照品的Ct值均小于30，而陰性對(duì)照品的Ct值均為none。

圖3 兩種方法提取新城疫病毒RNA效果的比較

2）由于是直接用陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品作為樣本來(lái)進(jìn)行，基本排除了樣本因素[3]（如樣本溶血等）對(duì)本試驗(yàn)的影響。因條件所限，沒(méi)有設(shè)立已知拷貝數(shù)的樣品進(jìn)行絕對(duì)定量的分析[4-5]，故無(wú)法計(jì)算出使用這兩種方法提取的起始模板量，待將來(lái)作進(jìn)一步研究討論。

3）從圖1-圖3可以看出，采用柱膜法提取的組分的Ct值均大于采用磁珠法提取的組分的Ct值，一般差2～3個(gè)循環(huán)。而Ct值越大則表明在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)越大，這就意味著相對(duì)磁珠法來(lái)說(shuō)，采用柱膜法提取的效果略差。

4）兩種方法雖然在試驗(yàn)結(jié)果上略有差異，但并不影響基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室對(duì)高致病性禽流感及新城疫病毒檢測(cè)定性的要求。柱膜法基本通過(guò)人工操作，對(duì)人員以及環(huán)境要求較高，且操作較為繁瑣，但費(fèi)用較磁珠法少。磁珠法通過(guò)儀器的精密控制，減少了人工操作環(huán)節(jié)引起的差異和錯(cuò)誤，通量較大，一次可以同時(shí)處理32個(gè)樣本（最多可處理96個(gè)樣本），但處理每個(gè)樣本的成本較高。因此，在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)自身情況選擇合適的方法來(lái)進(jìn)行高致病性禽流感及新城疫病毒RNA的提取。

[1]楊新,劉澤軍.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR定量分析mRNA表達(dá)水平原理及應(yīng)用[J].中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2003,4(2): 78-80.

[2]張麗,楊蓮茹,吳紹強(qiáng).核酸提取方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2011,28(12):75-78.

[3]高國(guó)生,姜俊,翁彭劍.不同標(biāo)本因素對(duì)熒光定量PCR法測(cè)定HBV DNA結(jié)果的影響[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2010,22(1): 37-38.

[4]盧體康,秦智鋒,陳兵,等.H7亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33 (3):9-13.

[5]孫軍峰,劉華雷,張維,等.體外轉(zhuǎn)錄法制備新城疫病毒熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010(4): 43-46.

Comparison of different RNA isolation methods for Highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease

Wu Wei Zhan Wenhui Li He Ying Qingxiang Liao Yuan Wang Bangyan
（Nanping Center for Animal Disease Control and Prevention,Fujian 353000）

Highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease do the great harm to poultry farmers,FQ-PCR have an advantage in detecting method of etiology and Nucleic acid extraction is the key.This article compares Centrifugal column extraction with magnetic bead method in order to find a better way in Basic veterinary laboratory.

Centrifugal column extractionmagnetic bead methodExtractionComparison

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1003-4331（2014）06-0007-02