畢榮璐，朱世曠，凌清華，周光召，劉祥義*

（1.西南林業(yè)大學(xué)，云南昆明 650224；2.云南森源化工有限公司，云南雙柏 675100）

·科學(xué)研究·

澳洲茶樹(shù)總黃酮的超聲波輔助提取

畢榮璐1，朱世曠1，凌清華2，周光召2，劉祥義1*

（1.西南林業(yè)大學(xué)，云南昆明 650224；2.云南森源化工有限公司，云南雙柏 675100）

為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)澳洲茶樹(shù)資源，以澳洲茶樹(shù)的總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用超聲波輔助提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)澳洲茶樹(shù)總黃酮的提取條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該方法的優(yōu)化條件為：溶劑為65%乙醇（體積分?jǐn)?shù)），料液比1∶25g／mL，超聲時(shí)間40 min；驗(yàn)證試驗(yàn)得到澳洲茶樹(shù)總黃酮的提取率為6.89%。

澳洲茶樹(shù)；黃酮；超聲波；提取

澳洲茶樹(shù)又稱(chēng)為互葉白千層（Melaleuca ahemifolia）、茶油樹(shù)（Tea tree），它是桃金娘科（Myrtaceae），白千層屬（Melaleuca L.），屬于低矮的灌木樹(shù)種，是一種短期栽種培育就可投入利用的經(jīng)濟(jì)林木［1］。據(jù)所查，澳洲茶樹(shù)葉中含有黃酮類(lèi)化合物［2］。黃酮類(lèi)化合物在自然界中廣泛存在，具有多種多樣的生物活性和藥理作用。在醫(yī)藥方面，黃酮類(lèi)化合物對(duì)治療冠狀動(dòng)脈硬化、腦血管疾病、心絞痛以及降低膽固醇、高血壓，抑制某些細(xì)菌及真菌有很好作用［3］。而在食品工業(yè)上，越來(lái)越多的以黃酮類(lèi)化合物為功能因子的保健食品正被開(kāi)發(fā)［3－4］。

目前，對(duì)澳洲茶樹(shù)的開(kāi)發(fā)利用基本上以其精油為主，除精油外的化學(xué)成分的研究與開(kāi)發(fā)利用較少［1］。在生產(chǎn)中，澳洲茶樹(shù)枝葉提取精油后剩余部分通常作廢棄料處理。本試驗(yàn)以澳洲茶樹(shù)葉總黃酮提取率為指標(biāo)，以超聲輔助提取法［5－7］提取澳洲茶樹(shù)葉中的總黃酮。通過(guò)對(duì)澳洲茶樹(shù)葉黃酮提取分離工藝的研究，為澳洲茶樹(shù)葉的二次開(kāi)發(fā)利用提供參考和依據(jù)，有助于實(shí)現(xiàn)澳洲茶樹(shù)資源的綜合利用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DZF－6030B型真空干燥箱，上海恒科公司；B2200S超聲波提取儀，上海必能信公司；微型植物組織粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器公司生產(chǎn)；HH －S型恒溫水浴箱，鄭州長(zhǎng)城科工；722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器公司生產(chǎn)；電子天平，梅特勒－托利多儀器上海有限公司。

澳洲茶樹(shù)樹(shù)葉，由云南森源化工有限公司提供。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 澳洲茶樹(shù)葉的預(yù)處理

稱(chēng)取已完全陰干的澳洲茶樹(shù)葉樣品約100 g，粉碎。樣品中加入石油醚，超聲提取20 min，濾去石油醚；重復(fù)此操作3至4次，至樣品中揮發(fā)性組分和色素基本萃取干凈。將樣品揮發(fā)，除盡石油醚，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取105℃干燥后恒重的蘆丁標(biāo)樣，用30%乙醇溶解定容于50 mL容量瓶中，搖勻備用。分別取上述蘆丁溶液0、0.5、1.0、1.5 L、2.0、2.5 mL于6只10 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，靜置6 min；加入0.4 mL 10%硝酸鋁，搖勻，靜置6 min；加入5 mL 4%的氫氧化鈉；最后，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min。以30%乙醇溶液為空白，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3 澳洲茶樹(shù)樣品中黃酮的含量測(cè)定

準(zhǔn)確移取澳洲茶樹(shù)樣品的黃酮提取液于容量瓶中，按照1.2.2項(xiàng)進(jìn)行顯色和吸光度A的測(cè)定。由1.2.2中得到的回歸方程式計(jì)算待測(cè)液中黃酮的質(zhì)量濃度ρ，然后按下式計(jì)算總黃酮含量。

總黃酮提取率＝濾液中黃酮質(zhì)量／澳洲茶樹(shù)樣品的質(zhì)量×100%

1.2.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取已預(yù)處理的澳洲茶樹(shù)樣品于錐形瓶中，分別對(duì)提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間3個(gè)影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，提取澳洲茶樹(shù)總黃酮后，將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。得到樣品的黃酮提取液，按1.2.2的方法顯色并測(cè)定吸光度，并按1.2.3的公式計(jì)算澳洲茶樹(shù)樣品中的總黃酮提取率。

1.2.5 最佳提取條件的確定

為進(jìn)一步優(yōu)化超聲輔助提取澳洲茶樹(shù)中黃酮的試驗(yàn)條件，將通過(guò)正交試驗(yàn)獲得提取的最佳條件。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)。

在最佳條件組合下，進(jìn)行5次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，以考察最佳條件的合理性和可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定

以蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在10～80 mg／L范圍內(nèi)與吸光度值有良好的線(xiàn)性關(guān)系。計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程為：A＝9.734 2ρ＋0.004 7，R2＝0.999 8。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g已處理好的澳洲茶樹(shù)樣品，選擇料液比為1∶20g／mL，提取溫度為常溫，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為45%、55%、65%、75%、85%、95%，超聲作用30 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1表明，黃酮類(lèi)化合物的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增高而提高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%～65%范圍內(nèi)增長(zhǎng)較快，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于75%后提取率變化較小。綜合考慮，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)65%～85%作為正交范圍較為合適。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Figure 1 The effect of different concentrations of ethanol on extraction rate of ultrasonic assisted extraction

2.2.2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g已處理好的澳洲茶樹(shù)樣品，常溫條件下，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、l∶20、1∶25、1∶30、1∶35，1∶40g／mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，超聲提取30 min。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Figure 2 The effect of ratio of material to liquid on extraction rate of ultrasonic assisted extraction

由圖2可知，隨著料液比的增大，提取率增高，但料液比達(dá)到1∶20g／mL以后增幅不大，綜合考慮，選擇1∶15、1∶20、1∶25g／mL為正交試驗(yàn)范圍。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g已處理好的澳洲茶樹(shù)樣品，試驗(yàn)條件為：常溫條件下，料液比1∶20g／mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，分別超聲提取5、10、15、20、30、40、50 min。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Figure 3 The effect of extraction time on extraction rate of ultrasonic assisted extraction

圖3表明，提取時(shí)間在5～20 min之內(nèi)提取率提高較快，20 min后提取率變化趨于平穩(wěn)。綜合考慮后，選擇20～40 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 最佳提取條件的確定

試驗(yàn)按L9（33）正交表安排實(shí)驗(yàn)，影響因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間，各因素和水平列于表1。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表1 超聲輔助提取正交試驗(yàn)表Table 1 Ultrasonic assisted extraction of L9（33）orthogonal test

表2 超聲輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test on ultrasonic assisted extraction

由表2、表3看出，3個(gè)因素對(duì)浸提效果影響的主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)B＞超聲提取時(shí)間A＞料液比C，最佳提取條件為A2B1C3，即溶劑使用65%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，料液比為1∶25g／mL，提取時(shí)間為40 min。

表3 超聲輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)Table 3 Orthogonal ultrasonic assisted extraction test results between the main effects

2.4 最佳工藝條件試驗(yàn)

按按照正交試驗(yàn)所得優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。以溶劑使用65%乙醇（體積分?jǐn)?shù)），料液比為1∶25g／mL，提取時(shí)間為40 min進(jìn)行超聲輔助提取，測(cè)得黃酮提取率為6.89%，證明正交試驗(yàn)所得優(yōu)化條件可靠。

3 結(jié)論

采用超聲輔助法提取澳洲茶樹(shù)中的總黃酮，并且通過(guò)單因素以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了溶劑濃度、料液比和超聲時(shí)間提取條件，確定了超聲輔助法提澳洲茶樹(shù)黃酮類(lèi)化合物的最佳條件為∶65%乙醇（體積分?jǐn)?shù)），料液比為1∶25g／mL，提取時(shí)間為40 min。超聲輔助法相比其它提取方法，提取時(shí)間大大縮短，效率提高明顯，為澳洲茶樹(shù)廢棄料的二次開(kāi)發(fā)利用提供了參考和依據(jù)。

［1］ 陳碧華，吳麗君，李乾振，等.澳洲茶樹(shù)研究進(jìn)展［J］.福建林業(yè)科技，2010，3（4）：177－182.

［2］ 劉布鳴，董曉敏，黃艷，等.互葉白千層的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2011，42（7）：1282－1284.

［3］ 田玉紅，陳志燕，陶明有.互葉白千層揮發(fā)性成分的提取和分析［J］.廣西工學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，22 （3）：45－48.

［4］ 李艷提，趙金鳳，張衛(wèi)明，等.羅布麻茶總黃酮含量測(cè)定方法［J］.食品科技，2010，35（6）：274－277.

［5］ 劉祥義.超聲波提取元寶楓葉總黃酮方法研究［J］.云南化工，2003，30（1）：27－28.

［6］ 陶亮亮，馬雄，丁雷濤，等.超聲輔助提取杜仲葉中黃酮的工藝研究［J］.江蘇調(diào)味副食，2011，28 （1）：7－10.

［7］ 李化.超聲技術(shù)在中草藥成分提取中的應(yīng)用［J］.中藥材，2001，24（4）：299－300.

Ultrasound－assisted Extraction of Flavonoids from the Melaleuca ahemifolia

BI Rong－lu1，ZHU Shi－kuang1，LING Qin－h(huán)ua2，ZHOU Guang－zhao2，LIU Xiang－yi1*

（1.Southwest Forestry University，Kunming 650224，China；2.SenYuan Chemical Ltd.Yunnan 675100，China）

To further develop Melaleuca resources，taking the total flavonoids extraction rate of the Melaleuca as evaluation standard，the extraction conditions of flavonoids from Melaleuca were studied by using of ultrasonic assisted extraction，and single factor test and orthogonal test.The results showed that the optimum conditions for ultrasound assisted solvent 65%（v／v）ethanol，solid－liquid ratio of 1∶25（g／mL），ultrasonic time 40min，extraction temperature is room temperature.Maximum yield is 6.89%.

Melaleuca；flavonoids；ultrasonic extraction

Q946

A

1004-275X（2014）04-0001-03

12.3969／j.issn.1004-275X.2014.04.001

收稿：2014-02-24

畢榮璐（1990－），女，傣族，碩士研究生，主要從事植物化學(xué)研究。

*通信聯(lián)系人：劉祥義（1964－），男，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)，E－mail：liuxy11＠126.com。