李克宏，白彥坤，周 巍，張 巖,，龐 軍，高文惠

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

植物蛋白不僅可以滿足人類對蛋白的需要，而且研究證明，植物蛋白在預(yù)防心腦血管疾病方面具有積極作用[1]，可以滿足現(xiàn)代人群對低脂、低糖、低熱能的健康食品需求[2]。植物蛋白廣泛應(yīng)用于食品加工中，相關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)迫切需要建立蛋白質(zhì)定性、定量的檢測方法保證食品質(zhì)量和安全[3-7]。

本實驗采用高效毛細管電泳法，對不同產(chǎn)地的核桃、杏仁、大豆、花生樣品中的蛋白質(zhì)進行檢測[8-14]，并利用指紋圖譜軟件[15-19]對4 種樣品中所含蛋白種類進行比對，找出每種樣品中的特征峰，以及樣品之間的共有峰，為快速有效地對目前市場存在的蛋白類飲料或其他食品中所添加蛋白類物質(zhì)進行區(qū)分，杜絕如用花生等廉價蛋白食品摻加入核桃，以次充好現(xiàn)象的發(fā)生，以保護消費者的合法權(quán)益，以期為政府和監(jiān)督部門的有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四硼酸鈉（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，分析純） 天津市海信化工有限公司；一步法活性蛋白質(zhì)提取試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CAPEL-105高效毛細管電泳儀（配有紫外-可見檢測器） 俄羅斯劉梅克斯公司；Sigma3-18K離心機 美國Sigma Laborzentrifugen GmbH公司；PHS-3C型pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；0.45 μm微孔濾膜 天津博納艾杰爾科技有限公司；XK96-A快速混勻器 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 緩沖溶液配制

稱取3.813 7 g四硼酸鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的SDS，用超純水定容至100 mL容量瓶中。調(diào)pH值到9.0，備用。以上溶液經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后備用。

1.3.2 色譜測定條件

色譜柱：彈性石英毛細管柱（50 cm×75 μm），分析電壓：12 kV；壓力進樣：1 kPa，時間5 s；柱溫：40 ℃；紫外檢測波長：200 nm[20]；毛細管2 次進樣之間用水沖洗5 min，緩沖液沖洗5 min。

1.3.3 樣品及處理

分別選取不同產(chǎn)地的核桃、杏仁、大豆、花生作為實驗樣品。取10 mg試樣剪成細小的碎片，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，加入1 mL一步法活性蛋白質(zhì)提取劑混合液，用塑料研磨棒或勻漿器，進行研磨或勻漿。直到?jīng)]有明顯的植物組織團塊，渦旋振蕩1～2 min，再8 000 r/min離心5 min，取下層水相過0.45 μm微孔濾膜后進樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物蛋白樣品測定

2.1.1 核桃樣品高效毛細管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對8 種不同產(chǎn)地的核桃樣品進行測定，根據(jù)不同產(chǎn)地核桃樣品的毛細管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立核桃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖1所示。

圖1 8 種不同產(chǎn)地核桃樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖對照Fig.1 Compariative chromatograms of different walnut samples from eight different geographic origins

表1 8 種不同產(chǎn)地核桃樣品共有特征峰保留時間表Table 1 Retention times of the common characteristic peaks of walnut samples from eigth areas min

由圖1和表1可以看出，核桃樣品中含有4 種共有特征峰，這4 種共有蛋白色譜峰可作為特征峰進行摻假鑒別。

2.1.2 杏仁樣品高效毛細管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對3 種不同產(chǎn)地杏仁樣品進行測定，根據(jù)不同產(chǎn)地杏仁樣品的高效毛細管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立杏仁標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖2所示。

圖2 3 種不同產(chǎn)地杏仁樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖對照Fig.2 Comparative chromatograms of apricot kernels from three different growing areas

表2 3 種不同產(chǎn)地杏仁樣品共有特征峰保留時間表Table 2 Retention times of the common characteristic peaks of apricot kernels from three growing areas min

由圖2和表2可以看出，杏仁樣品中含有4 種共有的特征峰，該4 種共有蛋白占據(jù)杏仁蛋白的90%以上，這4 個蛋白色譜峰可以作為杏仁蛋白摻假鑒別的特征峰。

2.1.3 大豆樣品高效毛細管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對2 種不同產(chǎn)地大豆樣品進行測定，根據(jù)不同產(chǎn)地大豆樣品的高效毛細管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立大豆標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖3所示。

圖3 2 種大豆樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋對照譜圖Fig.3 Comparative chromatograms of soybean samples from two different growing areas

通過對比圖3和表3可以確定，大豆樣品中的6 種共有蛋白可以作為大豆蛋白摻假鑒別的特征峰。

表3 2 種不同產(chǎn)地大豆樣品特征峰保留時間表Table 3 Retention times of the common characteristic peaks of soybean samples from two different growing areasmin

2.1.4 花生樣品高效毛細管電泳標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

對2 種不同產(chǎn)地花生樣品進行測定，根據(jù)不同產(chǎn)地花生樣品的高效毛細管電泳色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立花生標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖4所示。

圖4 2 種不同產(chǎn)地花生樣品標(biāo)準(zhǔn)指紋對照譜圖Fig.4 Comparative chromatograms of peanut samples from two different growing areas

表4 2 種不同產(chǎn)地花生樣品特征峰保留時間表Table 4 Retention times of the common characteristic peaks of peanut samples from two different growing areasmin

由圖4和對照表4可以看出，花生樣品譜圖中含有3 種共有的特征蛋白峰，該3種蛋白色譜峰可以作為花生蛋白摻假鑒別的特征峰。

2.1.5 不同植物蛋白樣品共有特征峰色譜圖

通過對不同產(chǎn)地核桃、杏仁、大豆、花生樣品的測定，確定該類樣品的特征譜圖，見圖5。

圖5 4種樣品特征譜圖Fig.5 Characteristic chromatograms of walnut, apricot kernel,soybean and peanut

從圖5可以看出，核桃具有4 種特征峰，杏仁具有4 種特征峰，大豆具有6 種特征峰，花生具有3 種特征峰，如果在樣品檢測電泳譜圖中出現(xiàn)了新的色譜峰，或者特征蛋白含量明顯減少，則可以確定該樣品為摻假樣品。

2.2 植物蛋白摻假樣品測定

本研究的重點旨在采用高效毛細管電泳法對植物蛋白食品中的特征蛋白質(zhì)進行檢測，其次提供鑒別植物蛋白摻假的一種思路和方法。本實驗過程中對于植物蛋白摻假樣品進行判定時，對實際樣品與摻假樣品質(zhì)量進行1∶1配制，即各取5 mg干燥的植物組織配制摻假樣品。

2.2.1 3號核桃摻1號花生對照譜圖

圖6 3號核桃1號花生指紋對照譜圖Fig.6 Chromatogram of mixture of walnut sample No.3 and peanut sample No.1

對摻假樣品進行測定，選擇3號核桃與1號花生樣品為摻假對象。由圖6可以看出，在核桃摻花生的圖譜中即出現(xiàn)了二者共有的特征峰，但也出現(xiàn)了1號花生與3號核桃譜圖中各自特有的蛋白峰。為此，將摻假圖與單純花生樣品和核桃樣品圖進行對比，根據(jù)色譜圖中相應(yīng)的特征峰可以進行摻假鑒別。

2.2.2 1號杏仁摻1號花生對照譜圖

圖7 1號杏仁1號花生指紋對照譜圖Fig.7 Chromatogram of mixture of almond sample No.1 and peanut sample No.1

對摻假樣品進行測定，選擇1號杏仁與1號花生樣品為摻假對象。由圖7可以看出，1號杏仁＋1號花生譜圖中，除去出現(xiàn)的杏仁和花生共有的植物蛋白峰之外，也出現(xiàn)了各自特有的蛋白峰。由于在分析過程中毛細管內(nèi)壁的Si—OH基團幾乎全部解離，壁表面帶負電荷較多，難以保證在每次分析時壁表面狀態(tài)完全一致，進而造成分析時電滲流大小有差異，引起遷移時間存在一定誤差。但由圖7指紋譜圖中出現(xiàn)的各自特有的蛋白峰可以進行初步摻假鑒別。

2.2.3 1號杏仁摻2號大豆對照譜圖

對摻假樣品進行測定，選擇1號杏仁與2號大豆樣品為摻假對象，由標(biāo)準(zhǔn)指紋對照譜圖8可以看出，出現(xiàn)了二者共有的植物蛋白峰，同時也出現(xiàn)二者所特有的蛋白峰，選用這些相應(yīng)的特征峰可以對摻假樣品進行鑒別。

圖8 1號杏仁2號大豆指紋對照譜圖Fig.8 Chromatogram of mixture of almond sample No.1 and soybean sample No.2

3 結(jié) 論

本實驗建立了一種簡便、快速的常用植物蛋白摻假鑒別的方法-毛細管電泳色譜法，樣品前處理采用了一步法活性蛋白質(zhì)提取試劑盒，該試劑盒專門用于提取植物蛋白，專一性強、提取液中雜質(zhì)少，可以確認提取液中植物蛋白成分占主要部分。采用中藥色譜指紋圖譜分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，找出同類樣品中共有特征峰，以及對不同植物蛋白互相摻假譜圖進行比對，通過特征峰及保留時間對摻假物質(zhì)進行鑒別。同時該實驗旨在為檢測植物蛋白食品中的特征蛋白質(zhì)和植物蛋白摻假鑒別提供一種方法，也為今后的植物蛋白摻假鑒別工作提供參考。

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