程威威，周 婷，吳 躍，林親錄，丁玉琴，王曉映

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻米及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

發(fā)芽糙米是糙米經(jīng)浸泡發(fā)芽后芽長達(dá)到一定長度的一種由糠層、胚芽及胚乳組成的糙米制品。糙米經(jīng)發(fā)芽后，不僅口感得到改善[1]，而且其營養(yǎng)成分和功能因子大量富積[2]，尤其是γ-氨基丁酸，約是未發(fā)芽糙米的3 倍，精白米的10 倍[3-4]。因此，Wu Fengfeng等[5]預(yù)測發(fā)芽糙米可能成為21世紀(jì)很受歡迎的健康食品。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是高等動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性傳導(dǎo)物質(zhì)。在體內(nèi)其作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)遞質(zhì)的前體直接參與神經(jīng)活動(dòng)，具有促進(jìn)脂肪消耗、降血壓、改善睡眠質(zhì)量、抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)腦部新陳代謝、抑制更年期自律失調(diào)及預(yù)防老年癡呆等功能[6]。因此，大量報(bào)道[7-8]是關(guān)于糙米發(fā)芽過程中GABA積累工藝的研究，而含量檢測是各項(xiàng)工作的基礎(chǔ)，尤為重要。近年來，國內(nèi)外對(duì)GABA分析的研究越來越多，但由于它對(duì)電化學(xué)和紫外、可見光的不靈敏性，一些常規(guī)的直接測定法靈敏度較低。目前測定GABA的方法有改良的Berthelot比色法[9]、氨基酸分析儀法[10]、改良紙層析法[11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12]、薄層掃描法[13]、分光光度法[14-15]等，其中柱前衍生HPLC法應(yīng)用最廣，其衍生方法有：丹磺酰氯法、氯甲酸芴甲酯法、異硫氰酸苯酯法、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯法、鄰苯二甲醛法，前4 種方法存在衍生過程復(fù)雜、速度慢或價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，而鄰苯二甲醛法不僅試劑具有價(jià)格便宜，而且衍生時(shí)間短、衍生條件簡單、過量試劑不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用最為廣泛，且紫外檢測器也是最常用的液相檢測器。本實(shí)驗(yàn)以鄰苯二甲醛為衍生試劑建立一種能快速、準(zhǔn)確地檢測發(fā)芽糙米中GABA含量的高效液相色譜-紫外分析方法，并對(duì)湖南省20種早秈稻品種發(fā)芽糙米中GABA含量進(jìn)行測定分析及比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集湖南省20 種2012年產(chǎn)早秈稻品種：中嘉早17、湘早秈45、華兩優(yōu)164、株兩優(yōu)233、株兩優(yōu)611、湘早秈24、湘早秈17、準(zhǔn)兩優(yōu)608、豐優(yōu)1167、浙福802、金優(yōu)233、兩優(yōu)527、湘早秈143、株兩優(yōu)268、株兩優(yōu)211、T優(yōu)167、湘早秈42、凌兩優(yōu)942、株兩優(yōu)199、株兩優(yōu)819，其含水量在11.22%～13.41%，千粒質(zhì)量為17.42～20.45 g，經(jīng)分樣篩去除雜物后，放置于4 ℃冰柜中。

GABA標(biāo)品（純度≥99%）、鄰苯二甲醛 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國Tedia試劑公司；甲醇（色譜純） 韓國SK公司；2-巰基乙醇 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙酸鈉、冰乙酸、硼酸（均為分析純） 國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜分析儀（SPD-20A紫外檢測器）日本島津公司；RAZ-128A型人工氣候箱 寧波江南儀器廠；L530型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；JLGJ4.5型檢驗(yàn)礱谷機(jī) 浙江臺(tái)州糧儀廠；QE-200 g型高速萬能粉碎機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司；R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi Labortecknic AG公司；AL204型分析天平、FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZOOMWO-L型超純水系統(tǒng)湖南中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽糙米的制備

從冰柜中取出除雜后的稻谷，經(jīng)礱谷后人工精選出優(yōu)質(zhì)糙米，將其平鋪于發(fā)芽紙上，置于37 ℃、95% RH的人工氣候箱中培養(yǎng)10 h，50 ℃條件下干燥至水分含量14%左右，取出后置于－18 ℃冰箱中備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取50 mg的GABA標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容于50 mL的容量瓶中，振蕩搖勻，配制成1 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稀釋至0.005、0.01、0.02、0.04、0.06 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，備用。

1.3.3 GABA樣品液的制備

將1.3.1節(jié)制備的發(fā)芽糙米用粉碎機(jī)充分粉碎后過100 目篩（過篩率≥90%），然后稱取3 g發(fā)芽糙米粉置于三角瓶中，加入50 mL 60%的乙醇溶液，水浴振蕩3 h，4 000 r/min離心20 min，上清液移入茄形瓶中，重復(fù)上述操作，合并上清液，混合，濃縮至10 mL，備用。

1.3.4 鄰苯二甲醛衍生液的制備

取10 mg鄰苯二甲醛用0.5 mL甲醇溶解后，加入0.4 mol/L的硼酸緩沖液（pH 10.2）2 mL和2-巰基乙醇30 μL，4 ℃條件下可存放2 d。

1.3.5 衍生化反應(yīng)

取發(fā)芽糙米樣品或GABA標(biāo)準(zhǔn)液20 μL于樣品瓶中，加入鄰苯二甲醛衍生液100 μL，渦旋振蕩5 s，靜置2 min后，過0.45 μm濾膜，取10 μL進(jìn)樣。

1.3.6 色譜分析條件

色譜柱：Intertsil ODS-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為25 mmol/L的乙酸鈉，用4%的乙酸調(diào)pH值至5.90±0.05；流動(dòng)相B為純乙腈；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長332 nm；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)分析

HPLC色譜圖采用島津Labsolution工作站采集，使用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.6進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

為提高分析靈敏度，選擇最佳波長是關(guān)鍵，為此特配制0.04 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其與鄰苯二甲醛衍生液進(jìn)行衍生，以沒有添加GABA的空白液做比對(duì)，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜分析。GABA衍生物的紫外光譜掃描圖如圖1所示，GABA衍生物的最大吸收波長為332 nm。

圖1 GABA衍生物的紫外掃描圖Fig.1 UV spectrum of derivatized GABA

2.2 GABA的定性分析

在1.3.6節(jié)色譜分析條件下，在Intertsil ODS-C18柱上對(duì)衍生的標(biāo)樣和發(fā)芽糙米樣品組分進(jìn)行了有效地分離。不添加GABA的空白衍生液、標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)芽糙米樣品的色譜圖見圖2。對(duì)比可見，GABA的保留時(shí)間為18.8 min左右；發(fā)芽糙米樣品中其他共存氨基酸和雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的測定無干擾。

圖2 不添加GABA的空白衍生液（A）、標(biāo)準(zhǔn)品（B）和發(fā)芽糙米樣品（C）的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank derivatization agent (A), standard substance (B) and germinated brown rice sample (C)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將0.005、0.01、0.02、0.04、0.06 mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別衍生后進(jìn)行色譜測定，以峰面積為橫坐標(biāo)X，以待測樣品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)Y/（mg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），得回歸方程Y=9.26×106X＋2 093.79，回歸系數(shù)r=0.999 5。由此說明，GABA的量在0.005～0.06 mg/mL之間時(shí)，本測定方法呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限為2.927 ng。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一發(fā)芽米樣品平行實(shí)驗(yàn)5 次，并計(jì)算樣品中GABA的平均含量、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表2所示，GABA衍生物峰面積的RSD為0.57%，GABA質(zhì)量濃度的RSD為0.56%。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision tests

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

分別取一定質(zhì)量濃度的發(fā)芽糙米樣品5 份，按待測樣品液GABA含量的80%、100%、120%添加標(biāo)準(zhǔn)品，測定GABA含量，計(jì)算回收率。如表3所示，此HPLC色譜方法測定GABA的回收率達(dá)98.85%～100.94%。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery tests

2.6 發(fā)芽糙米樣品測定

按1.3.5、1.3.6節(jié)樣品衍生處理方法和色譜分析方法，隨機(jī)抽取湖南省早秈稻品種20 種，相同條件下制備發(fā)芽糙米，分別測定各糙米樣本中GABA含量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，結(jié)果如圖3所示。20 種發(fā)芽糙米中GABA含量在22.68～88.36 mg/100 g（干基）?？梢?，20 種發(fā)芽糙米中GABA含量不盡相同，如中嘉早17（88.36 mg/100 g）、浙福802（76.32 mg/100 g）中GABA含量明顯高于其他；而株兩優(yōu)199、湘早秈143、株兩優(yōu)233及兩優(yōu)527中GABA含量則無明顯差異（P＞0.05）。這與Karladee等[16]的結(jié)論具有一致性。

圖3 20 種發(fā)芽糙米中GABA含量的測定結(jié)果Fig.3 GABA contents in germinated brown rice from 20 cultivars

3 結(jié) 論

本方法采用鄰苯二甲醛為柱前衍生劑，反相高效液相-紫外檢測器法測定發(fā)芽糙米中GABA的含量。與6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯法[12]、2,4-二硝基氟苯法[17]相比，該方法檢測成本低，鄰苯二甲醛價(jià)格便宜且用量較少；衍生過程在室溫條件下進(jìn)行，只需將鄰苯二甲醛與GABA樣品混合即可反應(yīng)，操作較簡單；反應(yīng)用時(shí)短，僅需2 min；鄰苯二甲醛毒性較小，故易于推廣應(yīng)用，回收率在99.18%～100.94%。張繼紅等[18]采用鄰苯二甲醛作為衍生劑，RP-HPLC-熒光檢測胚芽米中GABA含量，而本方法使用紫外檢測器，更具有普通性和適用性，且精密度和回收率均較上述方法好。應(yīng)用本方法測定湖南省20 種早秈品種發(fā)芽糙米中GABA含量，其結(jié)果為22.68～88.36 mg/100 g干基，得知發(fā)芽糙米中GABA含量因稻米品種的不同而含量不盡相同。在實(shí)際生產(chǎn)中，該結(jié)論可為發(fā)芽糙米副產(chǎn)品原料的選擇提供參考。

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