李曉然，龔福明,2，李 潔，羅義勇，柳陳堅(jiān),

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.德宏職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)系，云南 芒市 678400）

發(fā)酵食品是指利用益生微生物加工制造而成的一類具有獨(dú)特風(fēng)味與營養(yǎng)價(jià)值的食品，其中，豆豉是以大豆或黃豆為主要原料，經(jīng)由原料處理、制曲及后發(fā)酵三階段釀制而成，它不僅風(fēng)味獨(dú)特，而且還富含多種生理活性物質(zhì)。由于云南省獨(dú)特的地理位置、氣候條件和民族文化傳統(tǒng)，生物資源繁多，發(fā)酵食品中具有獨(dú)特和寶貴的微生物資源，由于缺乏對這些微生物全面的了解，這些寶貴的資源仍未得到很好的開發(fā)。

在過去的幾十年中，大多數(shù)的微生物生態(tài)學(xué)家都在致力于分離和鑒定特殊環(huán)境中的微生物類群，通過這種方法已經(jīng)獲得了許多非常有用的信息。然而，由于許多微生物無法在實(shí)驗(yàn)室中通過常規(guī)培養(yǎng)得到，這使得可培養(yǎng)微生物的范圍非常有限。基于分子生物學(xué)技術(shù)的針對rRNA基因的探索極大地促進(jìn)了環(huán)境中微生物群落多樣性的研究。rRNA基因在細(xì)胞中相對穩(wěn)定，同時(shí)含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個(gè)重要指標(biāo)[1-2]。2008年，Hamady等[3]展示了一種使用焦磷酸測序可以同時(shí)平行分析多個(gè)樣品的策略，在對不同的樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增時(shí)在引物的5’末端加上由8個(gè)堿基組成的標(biāo)記（barcode），在同一次測序反應(yīng)中同時(shí)分析了286個(gè)環(huán)境樣品，由于使用高通量測序，每一個(gè)樣品都可以得到較多的序列。這一方法在分析多個(gè)樣品微生物群落多樣性領(lǐng)域得到了極為廣泛的應(yīng)用。

然而，在對微生物群落進(jìn)行DNA提取的過程中，游離于細(xì)胞外的DNA以及已經(jīng)死亡的細(xì)胞的DNA依然會(huì)被提取出來并進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，因此，基于DNA的分子生物學(xué)方法往往會(huì)因?yàn)檫@些非活性的DNA的存在而高估樣品的微生物多樣性。另外，在發(fā)酵食品中，并非所有的細(xì)菌都對食品發(fā)酵起作用，尤其是傳統(tǒng)發(fā)酵方法制作的食品，其微生物來源于發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵環(huán)境，很多的微生物可能是死亡或者不起作用。

因此，在本研究中，對豆豉樣品先采用富集細(xì)菌的液體培養(yǎng)基進(jìn)行混合培養(yǎng)，對其中活著的細(xì)菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后對培養(yǎng)液提取總的DNA，再進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增和焦磷酸測序，以此來分析豆豉中具有活性的細(xì)菌群落。將混合培養(yǎng)和16S rRNA基因高通量測序的方法結(jié)合起來可以分析發(fā)酵食品中具有活性的主要細(xì)菌種類及其相對豐度，為研究發(fā)酵食品中微生物群落提供更加全面而準(zhǔn)確的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆豉 云南省迪慶自治州（香格里拉）菜市場，為傳統(tǒng)發(fā)酵制成的加辣椒等調(diào)料的發(fā)酵大豆，兩個(gè)樣品分別命名為XG_1和XG_2。購買后置于冰盒中運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，－80℃保存。

DNA提取裂解緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L EDTA、0.75 mol/L蔗糖。

1.2 儀器與設(shè)備

Labnet230V EU渦旋儀 美國Labnet公司；ABI 7200PCR儀 美國ABI公司；羅氏GS-FLX測序儀 瑞士Roche公司；Nanodrop ND-1000分光光度計(jì) 美國Thermo公司；Sigma 3-18K離心機(jī)、玻璃珠（直徑212～300 m） 美國Sigma公司；Premix Ex Taq?日本TaKaRa公司；QIAquick gel Extraction Kit 德國Qiangen公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)培養(yǎng)

在無菌培養(yǎng)下稱取豆豉樣品1.0 g，置于5 mL生理鹽水中進(jìn)行研磨和振蕩，取混合液體20 μL接種至5 mL NA培養(yǎng)基中，置于35 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 DNA提取

DNA提取參考Schmidt等[4]的方法并做了部分改變，步驟如下：取1 mL混合培養(yǎng)液離心收集菌體，加入450 μL裂解緩沖液和10 μL 50 mg/mL溶菌酶，37 ℃水浴30 min。加入25 μL 20% SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，55 ℃水浴2 h以上后，加入0.1 g玻璃珠，于渦旋儀上以最高轉(zhuǎn)速振蕩5 min，之后將離心管放置于研缽中，加入液氮凍融3次。加入80 μL 5 mol/L NaCl和60 μL 10 g/100 mL CTAB，小心混勻，65 ℃水浴20 min。分別用等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）和氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）抽提一次。加入0.6倍體積的異丙醇于－20 ℃沉淀DNA，最后加入50 L TE（0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.001 mol/L EDTA，pH 8.0）緩沖液溶解DNA。提取好的DNA保存于－20 ℃。

1.3.3 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增和焦磷酸測序

使用細(xì)菌的16S rRNA基因V3～V5高變區(qū)通用引物對提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增使用通用引物338F（5’-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3’）和907R（5’- CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3’），并在引物338F的5’末端添加8個(gè)堿基的標(biāo)記。為了減少PCR產(chǎn)物中非特異性擴(kuò)增的異源雙鏈DNA的含量，將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模板后按照原來的條件再做5個(gè)循環(huán)[5]。PCR擴(kuò)增采用Premix Ex Taq?具體體系及程序如下。在50 μL 的PCR反應(yīng)體系中：ddH2O 18 μL，正向引物（5 μmol/L） 2 μL，反向引物（5 μmol/L）2 μL，Premix Ex Taq? 25 μL，模板（15 ng）3 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

將PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后將凝膠浸泡于含有20 g/mL EB的TAE緩沖液中10 min后在紫外燈（216 nm）照射下呈現(xiàn)橙色的條帶，目標(biāo)條帶割下后使用QIAquick gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物。使用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)將純化好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定量。由國家人類基因組南方研究中心使用焦磷酸測序?qū)NA進(jìn)行測序。

1.3.4 測序結(jié)果分類鑒定

對于焦磷酸測序的測序結(jié)果分析質(zhì)量文件，去掉含有“N”的序列，并對序列長度進(jìn)行篩選，刪掉長度小于300 bp的序列，根據(jù)Barcode將序列確定各個(gè)本樣品的序列，并去除Barcode和引物序列，得到有效的序列文件。使用Mallard v1.02[6]來檢測PCR產(chǎn)物序列中的嵌合體。使用mothur v1.25.1[7]的classify.seqs命令，采用Silva的核糖體小亞基RNA（SSU rRNA）序列數(shù)據(jù)庫V102[8]的分類信息，得到序列的分類信息，分別采用80%的置信區(qū)間。

1.3.5 多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析

對所有序列使用Mothur v1.25.1[7]進(jìn)行比對，以0.02和0.05為Cutoff值劃分可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。計(jì)算Cutoff為0.02和0.05時(shí)的ACE和Chao1值，并繪制Rarefaction曲線。從細(xì)菌16S rRNA基因序列中每個(gè)OTU選取代表序列，將其在NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST比對，將結(jié)果中具有確定分類信息的序列用ClustalX 1.83[9]進(jìn)行比對，將比對的結(jié)果用Mega v4.0[10]中的鄰接法（Neighbour-Joining）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列信息和多樣性指數(shù)

對焦磷酸高通量測序的結(jié)果進(jìn)行分析，通過添加的Barcode將序列分到兩個(gè)樣品中，XG_1有478條序列，XG_2有437條序列，對兩個(gè)序列文件進(jìn)行長度和質(zhì)量刪選，去掉含有“N”的序列，將大于350 bp的序列用來做后續(xù)分析，XG_1有417條序列，XG_2有384條序列。

為了消除不同序列數(shù)目對多樣性指數(shù)的影響，在兩個(gè)樣品中都隨機(jī)選取380條序列來分析其多樣性指數(shù)，分別以0.02和0.05為Cutoff，OTU數(shù)目、Singleton（有2條序列的OTU）、Doubleton（有2條序列的OTU）數(shù)目以及多樣性指數(shù)ACE和Chao1值如表1所示。所有多樣性指數(shù)均顯示，樣品XG_1的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于XG_2，在Cutoff為0.02時(shí)，即大約相當(dāng)于種的分類水平時(shí)，兩個(gè)樣品均顯示了較高的多樣性，然而在Cutoff為0.05，即大約相當(dāng)于屬的分類水平時(shí)，XG_1的多樣性還較高，而XG_2的多樣性已經(jīng)很低。圖1顯示了OTU數(shù)目隨著序列數(shù)增長情況的Rarefaction曲線，在Cutoff為0.05時(shí)，兩個(gè)樣品的曲線均呈現(xiàn)出了接近平臺的趨勢，而在Cutoff為0.02時(shí)，兩個(gè)曲線的上升趨勢還很明顯，說明在種的水平上，測序量可能還不能完全反映兩個(gè)樣品的多樣性。

表1 基于Cutoff 0.02和0.05的細(xì)菌豐度Table 1 Bacterial richness with cutoffs of 0.02 and 0.05

圖1 根據(jù)Rarefaction方法估計(jì)豆豉樣品細(xì)菌的多樣性Fig.1 Estimated OTU numbers according to the rarefaction method depending on OTU identification with the cutoffs of 0.02 and 0.05

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

根據(jù)Silva的SSU rRNA序列數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行分類，兩個(gè)樣品中所有的序列都屬于厚壁菌門（Firmicutes）。對于XG_1，厚壁菌門中包含了3個(gè)目，分別是乳酸桿菌目（Lactobacillales，264條序列，63%），芽孢桿菌目（Bacillales，149條序列，36%）和候選目432-1（Candidate order 432-1，4條序列，1%）。在乳酸桿菌目中，146條序列屬于腸球菌科（Enterococcaceae），88條序列屬于乳酸桿菌科（Lactobacillaceae），21條序列屬于肉桿菌科（Carnobacteriaceae）；在芽孢桿菌目中，全部序列都屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）。另一個(gè)樣品XG_2的細(xì)菌群落則更為簡單，厚壁菌門中包含了2個(gè)目，分別是芽孢桿菌目（367條序列，96%）和候選目432-1（17條序列，4%）。芽孢桿菌目中所有序列全部屬于芽孢桿菌科。可見，在XG_1中，具有活性的優(yōu)勢菌為乳酸菌，而在XG_2中則為芽孢桿菌。

將在Cutoff為0.02時(shí)兩個(gè)樣品共81個(gè)OTU進(jìn)行分析，去除Singleton和Doubleton后的23個(gè)OTU用來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。兩個(gè)樣品中具有活性的細(xì)菌種類是不一樣的，大多數(shù)的OTU都屬于芽孢桿菌科，尤其是XG_2，全部的OTU都在這個(gè)科中，豐度最高的OTU為XG_2_M4，有267條序列（70%），它與枯草芽孢桿菌亞種（Bacillus subtilissubsp.subtilis6051-HGW）（CP003329）呈現(xiàn)出較高的相似度。在XG_2中，豐度第二高的OTU為XG_2_DT，有47條序列（12%），其16S rRNA基因序列與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicusstrain CBMB205）（EU194897）顯示出較高的相似度，同時(shí)，在XG_1中豐度第二高的OTU XG_1_AF也可鑒定為這一細(xì)菌。OTU XG_2_0X包含27條序列（7%），經(jīng)過鑒定，與炭疽桿菌（B.anthracisstrain g9B-2）（HQ238757）相似度較高，這株菌是在小麥發(fā)酵食品的生產(chǎn)房間中檢測到的。

圖2 細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences and their phylogenetic relationships

在樣品XG_1中，樣品的均一度與XG_2也不一樣，豐度最高的OTU XG_1_EJ僅有103條序列，占25%，這個(gè)OTU屬于腸球菌科，其16S rRNA基因序列與多株腸球菌如耐久腸球菌（Enterococcus durans）、蒙氏腸球菌（E.mundtii）和海氏腸球菌（E.hirae）均顯示了較高的相似度，并和從米糠中分離到的16S rRNA基因序列也呈現(xiàn)了較高的相似度（AB671280）。豐度第三的OTU為XG_1_NA，有58條序列，占14%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與乳酸片球菌（Pediococcus acidilacticistrain Ni1001）（AB598949）聚類在一起。此外，從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，有部分序列不能與已知分類信息的細(xì)菌16S rRNA基因序列完全聚類在一起，也暗示了在這兩個(gè)樣品中，有部分細(xì)菌是未培養(yǎng)細(xì)菌，值得更為深入的研究。

3 討 論

本研究使用了培養(yǎng)和分子生物學(xué)高通量測序方法的結(jié)合，對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的主要種類之一豆豉中具有活性的細(xì)菌群落進(jìn)行了分析。這種方法既規(guī)避了實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對微生物種類的限制，同時(shí)由于在DNA提取之前進(jìn)行了富集培養(yǎng)的步驟，使得在樣品中具有活性的細(xì)菌得到富集生長，也避免了直接使用分子生物學(xué)方法分析而受到樣品中死細(xì)胞的干擾從而高估了細(xì)菌多樣性。

在樣品XG_1中，豐度最高的OTU與耐久腸球菌或蒙氏腸球菌的序列具有明顯的相似性。在以前的研究中，耐久腸球菌被認(rèn)為有抗真菌活性，在發(fā)酵食品中，真菌尤其是霉菌的污染和增殖是食品變質(zhì)的重要方面，因此，耐久腸球菌的這一特性無疑為食品提供了保鮮成分，延長其保存時(shí)間。而蒙氏腸球菌則有產(chǎn)生細(xì)菌素的能力[11]，細(xì)菌素也是乳酸菌產(chǎn)生的具有生物防腐的物質(zhì)之一。其次為可鑒定為枯草芽孢桿菌的OTU，這一OTU也是樣品XG_2中的優(yōu)勢菌?？莶菅挎邨U菌雖然在自然界中廣泛存在，如土壤[12]、空氣[13]等，近年來，也在人體腸道樣品中多次檢出[14]，被認(rèn)為是正常的腸道菌群，與人類共生?？莶菅挎邨U菌在食品發(fā)酵中也發(fā)揮著重要作用，如日本納豆中就是由納豆枯草芽孢桿菌（B.subtilis natto）發(fā)酵而成，可以釋放胞外蛋白酶來消化大豆蛋白[15]。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌也同樣遍布在土壤[16]和海水[17]中，也有研究證明一株分離自土壤的該菌可以產(chǎn)纖維素酶[18]，在大豆發(fā)酵中也起到降解纖維素的作用。豐度第三高的OTU被鑒定為乳酸片球菌，這是食品發(fā)酵中重要的乳酸菌之一，也是主要的益生菌之一，可以用于發(fā)酵蔬菜、乳制品和肉類。乳酸片球菌還可以保護(hù)腸道，使病原體如痢疾桿菌、沙門氏菌等在腸道定殖[19]。在以前的研究中，尚未有任何研究證明乳酸片球菌有毒性作用，因此非常適合作為益生菌用于發(fā)酵食品。在樣品XG_2中另一個(gè)主要的OTU被鑒定為炭疽桿菌，研究證明，在多種食品相關(guān)樣品中都檢測到了炭疽桿菌的孢子[20-21]。然而，值得注意的是，芽孢桿菌可以形成內(nèi)生孢子，能夠承受極端的環(huán)境條件。因此，在兩個(gè)樣品中存在的具有活性的芽孢桿菌，并不能準(zhǔn)確判斷其來源及作用，若要了解其在豆豉發(fā)酵中的具體作用，還需要進(jìn)一步的活性測試和基于RNA的相關(guān)分析。

本研究分析的兩個(gè)豆豉樣品培養(yǎng)液的細(xì)菌多樣性，其中一個(gè)樣品不具有明顯的優(yōu)勢菌，主要的細(xì)菌為腸球菌、乳酸片球菌和甲基營養(yǎng)型芽孢菌，另一個(gè)樣品主要的優(yōu)勢菌為枯草芽孢桿菌。作為乳酸菌的重要組成部分，腸球菌和乳酸片球菌在發(fā)酵食品中的作用非常重要和明顯，然而，芽孢桿菌由于其廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力，也可以在食品發(fā)酵中發(fā)揮作用，因此在本研究中很難明確其作用，這一點(diǎn)仍需結(jié)合功能基因的表達(dá)進(jìn)行更為深入的研究。

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