李富華，劉 冬，明 建,3,4,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055；3.西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶 400715；4.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全與風險評估重點實驗室，重慶 400715）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是機體正常代謝的產(chǎn)物，一方面ROS能殺傷侵入體內(nèi)的細菌，并能消除炎癥和化學物質(zhì)，此外，自由基還能促進前列腺素、凝血酶原、膠原蛋白的合成，參與肝臟解毒、調(diào)節(jié)細胞分裂等；另一方面ROS能使構成細胞組織的各種物質(zhì)，如脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生各種氧化反應，引起變性、交聯(lián)、斷裂等氧化傷害，進而導致細胞結構和功能的破壞以及機體組織的損傷和器官的病變，研究發(fā)現(xiàn)，自由基幾乎與人類的大部分疾病有關，如動脈粥樣硬化、血栓的形成、心肌缺血再灌注損傷、糖尿病以及致癌，促癌和癌的形成過程中均有自由基的產(chǎn)生或參與[1-4]。因此，具有清除活性氧自由基功能的天然抗氧化物質(zhì)——黃酮類化合物，已成為功能性成分研究領域的熱點。黃酮類化合物主要是指基本母核為2-苯基色原酮（2-phenyl-chromone）類化合物，此類化合物具有多個苯環(huán)和酚羥基結構，由于其苯環(huán)上的羥基極易失去氫電子，可作為良好的電子供體而發(fā)揮抗氧化功能，能保護細胞膜上的不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）免于氧化[5-6]。此外，流行病學研究表明，經(jīng)常攝食富含生物黃酮類化合物的食物能有效降低腫瘤、心腦血管疾病等慢性病的發(fā)生[7-9]。

蕎麥屬蓼科一年生草本植物，一般分為甜蕎麥（Fagopyrum esculentumM ench）和苦蕎麥（Fagopyrum tartaricum(L.)Gaerth亦稱韃靼蕎麥）兩種，另有野生的宿根蕎麥（F.symosum）為非食用品種[4]。苦蕎因富含B族維生素、微量元素和生物類黃酮，而兼具營養(yǎng)和保健的雙重功效[4,10]。苦蕎中黃酮類化合物含量約是甜蕎黃酮含量的30倍，并明顯高于其他谷物或果蔬，且主要分布在苦蕎麩皮部位[4,11-14]。目前，對苦蕎黃酮類化合物的研究多涉及苦蕎黃酮提取工藝的優(yōu)化及苦蕎黃酮含量及其組成成分的鑒定等方面[10,15-17]。對苦蕎黃酮類化合物抗氧化性的研究多停留在檢測其化學抗氧化活性[8,13]，但化學分析法往往忽略了抗氧化劑在機體中的攝入、生物利用率及生理代謝等生物指標而不能準確地反映抗氧化劑的體內(nèi)抗氧化能力[18]。細胞抗氧化活性實驗（cellular antioxidant activity，CAA）則能兼顧生物相關性、抗氧化劑在細胞內(nèi)的分布以及生理代謝等因素[19]。因此通過細胞模型檢測抗氧化劑清除細胞內(nèi)ROS能力來評估抗氧化劑是否具有細胞內(nèi)抗氧化活性是一種相對較為科學合理的方法。

為準確評價苦蕎麩皮黃酮的功能性，本實驗既采用了相對較為準確的化學抗氧化方法——氧自由基清除能力或抗氧化能力指數(shù)測定法（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），又應用人肝癌細胞HepG2模型，評價苦蕎麩皮黃酮的抗氧化活性和抗腫瘤細胞增殖能力，為苦蕎麩皮功能性食品開發(fā)及抗腫瘤藥物的研發(fā)提供實驗資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)自重慶酉陽和四川西昌的兩種苦蕎籽粒的麩皮；HepG2人肝癌細胞 美國菌種保藏中心。

乙醇、福林酚試劑、蘆丁、沒食子酸均（分析純）成都科龍化學試劑廠；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（fluorescein isodium salt, 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFHDA）、2,2’-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（2,’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，ABAP）、熒光素鈉鹽（fluorescein disodium salt，F(xiàn)L）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（N-2-hydro xyethylpiperazine-N-ethanesulphonicacid，Hepes）、青霉素、鏈霉素混合液（×100）、臺盼藍（0.4%） 美國Sigma公司；HepG2細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.05%胰酶-EDTA消化液（trypsin- ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA） 美國Gibco公司；細胞培養(yǎng)瓶、96孔板 美國Corning公司。

1.2 儀器與設備

HERA Cell 240型CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；BHC-ⅡA2系列生物安全柜 蘇凈安泰空氣技術有限公司；DM IRB型熒光倒置顯微鏡 德國Leica儀器有限公司；Spectra Max M2型連續(xù)光譜密度熒光檢測儀美國Molecular公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎麩皮黃酮提取

參考熊雙麗等[16]，并根據(jù)本實驗室條件稍作修改，即苦蕎麩皮與80%的乙醇水溶液按料液比1∶35（m/V）混合，75 ℃水浴2.5 h，將所得提取液于3 500×g條件下，離心10 min，并將上清液于45 ℃條件下，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以超純水定容至10 mL，得苦蕎麩皮黃酮提取液，置于-80 ℃，于3周內(nèi)分析檢測。

1.3.2 苦蕎麩皮黃酮含量測定

蘆丁標準曲線制作方法參考熊雙麗等[16]，苦蕎麩皮黃酮含量以每克麩皮所含的毫克蘆丁當量（mg蘆丁/g）表示。所得蘆丁含量與吸光度的回歸方程為：y=0.927 6x＋0.014 6（R2=0.998 5），式中：y為吸光度；x為蘆丁含量/mg。

蕎麥麩皮黃酮含量測定：準確吸取苦蕎麩皮黃酮提取液0.4 mL，并以30%乙醇補至1 mL，其余操作同蘆丁標準曲線制作。

1.3.3 過氧自由基吸收能力（ORAC）實驗

參考Faller[20]、Wolfe等[21]，在本實驗室稍作修改，即分別精確移取20 μL的磷酸緩沖液（空白）或不同質(zhì)量濃度的樣液、Trolox標液于96孔板的相應位置，再將該96孔板置于已預熱至37℃的酶標儀中，孵化10 min，然后按200 μL/孔加0.96 μmol/L熒光工作液，再于酶標儀中37 ℃孵化20 min后，按20 μL/孔加入119 mmol/L ABAP工作液，最后于激發(fā)波長485 nm，入射波長520 nm下立即讀數(shù)，每4.5 min進行一次讀數(shù)，共檢測2.5 h，每個樣品質(zhì)量濃度點做3個平行。黃酮的抗氧化性，結果以每克麩皮相當于μmol Trolox的量（μmol TE/g）表示。

1.3.4 細胞培養(yǎng)

HepG2人肝癌細胞用含5%胎牛血清的培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，用以實驗的細胞為12～35 代[20-21]。

1.3.5 細胞毒性實驗[22-24]

取對數(shù)生長期的HepG2細胞接于96孔白板，使每孔細胞數(shù)約為4×104個，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)4 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1次。其中，樣品孔中加入100 μL含樣品的培養(yǎng)基（每個質(zhì)量濃度梯度做3個平行孔），控制孔中加入100 μL的培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后開始測板：移去96孔板內(nèi)殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加50 μL/孔亞甲基藍溶液（98%HBSS、0.67%戊二醛、0.6%亞甲基藍），于培養(yǎng)箱中放置1 h，然后移去染色液，并用去離子水中清洗該96孔板至清洗液無色，吸去板中多余水分并風干2～3 min，加100 μL/孔洗脫液（49% PBS、50%乙醇、1%醋酸），然后漩渦振蕩20 min，使孔內(nèi)已染色的細胞形成均勻的細胞懸浮液，最后，于570 nm波長讀取各孔中染色細胞懸浮液的吸光度。減少的吸光度計算公式如式（1）所示。

1.3.6 細胞抗增殖實驗

采用Wolfe等[22]的方法并進行一定的改進[23-24]，即取對數(shù)生長期的HepG2細胞接于96孔白板，使每孔細胞數(shù)約為2.5×104個，于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)4 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1次。其中，樣品孔中加入100 μL含樣品的培養(yǎng)基（每個質(zhì)量濃度梯度做3個平行孔），控制孔中加入100 μL的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后開始測板，測板操作同上述細胞毒性實驗。細胞增殖抑制率計算公式如式（2）所示。

1.3.7 細胞抗氧化實驗[21-22]

1.3.7.1 PBS清洗實驗

將對數(shù)生長期的HepG2細胞接種到96孔板中（只接種內(nèi)部孔，為防止邊緣效應），每孔細胞數(shù)約為6×104個，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS清洗1次。加入新鮮培養(yǎng)基、苦蕎麩皮黃酮（終質(zhì)量濃度梯度為0、3.6、6.7、10、13.3、16.7、20 mg/mL）、DCFH-DA熒光探針溶液（終濃度為25 μmol/L）以及標準品槲皮素（終濃度梯度為0、3、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L）。

1.3.7.2 不經(jīng)PBS清洗實驗

基本操作同PBS清洗實驗，但苦蕎麩皮黃酮終質(zhì)量濃度梯度為0、2、4、6、8、10、12 mg/mL，DCFH-DA熒光探針溶液終濃度為25 μmol/L，標準品槲皮素終濃度梯度為0、1、2、3、4、5、6 μmol/L。

將上述96孔板，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h，移去殘余培養(yǎng)液，然后加入100 μL/孔PBS，清洗一次（PBS清洗實驗）或不經(jīng)PBS清洗（不經(jīng)PBS清洗實驗），加入100 μL/孔ABAP溶液（終濃度為600 μmol/L），然后，立即于發(fā)射波長538 nm，入射光波長485 nm條件下測定熒光值，測定1 h，每5 min測定3個重復孔。對照組用DCFH-DA和ABAP處理，不加苦蕎麩皮黃酮提物；空白組用DCFH-DA處理，不加入ABAP和苦蕎麩皮提物。

1.3.8 細胞抗氧化能力的定量[22]

減去空白和初始熒光值后，每個苦蕎麩皮黃酮質(zhì)量濃度對應時間-熒光值曲線下的面積即為CAA值，計算公式如式（3）所示。

式中：∫SA表示加入不同質(zhì)量濃度苦蕎麩皮黃酮提取物后的時間-熒光值曲線下積分面積；∫CA表示空白對照組的時間-熒光值曲線下積分面積。

苦蕎麩皮黃酮提取物的半數(shù)有效質(zhì)量濃度（EC50）根據(jù)lg（fa/fu）對lg（劑量）的中效原理來計算，式中：fa為樣品作用效應（CAA值），fu為1-CAA值，EC50值以3次平行實驗計算得出，將EC50值轉(zhuǎn)化為CAA值?？嗍w麩皮黃酮的CAA值以每100 g苦蕎麩皮相當于微摩爾槲皮素的量表示（μmol QE/100 g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 苦蕎麩皮黃酮含量

表1 兩種苦蕎麩皮黃酮含量及其抗氧化能力（ ±s, n=3）Table 1 Flavonoids contents and antioxidant activities of tartary buckwheat brans harvested from two different growing regions (± s,n=3)

表1 兩種苦蕎麩皮黃酮含量及其抗氧化能力（ ±s, n=3）Table 1 Flavonoids contents and antioxidant activities of tartary buckwheat brans harvested from two different growing regions (± s,n=3)

注：*.與T1相比，差異顯著（P＜0.05）。

苦蕎名稱 黃酮含量/（mg RE/g） ORAC/（μmol TE/g）T1 6.3±1.6 57.0±3.5 T2 5.6±1.3 73.6±6.3*

由表1可知，T1和T2苦蕎麩皮黃酮含量分別為（6.3±1.6）mg RE/g和（5.6±1.3）mg RE/g，兩者黃酮含量無顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 苦蕎麩皮黃酮的抗氧化能力

由表1可知，T1和T2的ORAC值分別為（57.0±3.5）μmol TE/g和（73.6±6.3）μmol TE/g，T2的ORAC值明顯高于T1（P＜0.05）。

2.3 苦蕎麩皮黃酮的細胞抗氧化能力

細胞抗氧化實驗采用兩種處理方法，PBS清洗實驗和不經(jīng)PBS清洗實驗。PBS清洗實驗主要反映在HepG2細胞內(nèi)抗氧化劑的抗氧化性；不經(jīng)PBS清洗實驗則主要反映包括HepG2細胞膜表面在內(nèi)的抗氧化劑的抗氧化性。HepG2細胞中，在苦蕎麩皮黃酮提取物的作用下，ABAP產(chǎn)生的過氧化氫自由基氧化DCFH的動力學曲線見圖1和圖2，實驗中所選取的樣品質(zhì)量濃度范圍均不顯示細胞毒性。

圖1 在PBS清洗實驗中，兩種苦蕎麩皮黃酮（a, b）和標準品槲皮素（c）對HepG2細胞內(nèi)熒光強度的影響（ ±s,n=3）Fig.1 Peroxyl radical-induced oxidation of DCFH to DCF in HepG2 cells and the inhibition of oxidation by flavonoids (a, b) extracted from T1 and T2 tartary buckwheat brans and by quercetin standard (c) with PBS washing ( ± s, n=3)

由圖1、2可知，苦蕎麩皮黃酮能有效抑制HepG2細胞中熒光物質(zhì)的生成，與對照組（0 mg/mL組）相比有顯著性差異（P＜0.05），且存在一定的時效關系，即在不產(chǎn)生細胞毒性的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著T1和T2苦蕎麩皮黃酮質(zhì)量濃度的升高，細胞內(nèi)熒光強度降低，當T1和T2苦蕎麩皮黃酮的質(zhì)量濃度達到20、12 mg/mL時，細胞內(nèi)熒光強度最低，即此時樣品的細胞抗氧化能力最強。

圖2 在不經(jīng)PBS清洗實驗中，兩種苦蕎麩皮黃酮（a, b）和標準品槲皮素（c）對HepG2細胞內(nèi)熒光強度的影響（ ±s,n=3）Fig.2 Peroxyl radical-induced oxidation of DCFH to DCF in HepG2 cells and the inhibition of oxidation by flavonoids (a, b) extracted from T1 and T2 tartary buckwheat brans and by quercetin standard (c) without PBS washing ( ±s, n=3)

表2 兩種苦蕎麩皮黃酮的細胞抗氧化能力及細胞毒性質(zhì)量濃度（ ±s,n=3）Table 2 Cellular antioxidant activities and cytotoxic concentration of flavonoids extracted from T1 and T2 tartary buckwheat brans（ ±s, n=3)

表2 兩種苦蕎麩皮黃酮的細胞抗氧化能力及細胞毒性質(zhì)量濃度（ ±s,n=3）Table 2 Cellular antioxidant activities and cytotoxic concentration of flavonoids extracted from T1 and T2 tartary buckwheat brans（ ±s, n=3)

苦蕎名稱 CAA/（μmol QE/100 g） 毒性質(zhì)量濃度/（mg/mL）PBS清洗 不經(jīng)PBS清洗T1 44.4±5.2 32.9±3.2 25 T2 52.5±2.7 30.9±2.2 25

由表2可知，在PBS清洗處理中，T1和T2苦蕎麩皮黃酮的CAA值分別為（44.4±5.2）μmol QE/100 g和（52.5±2.7）μmol QE/100g；在不經(jīng)PBS清洗處理中，T1和T2苦蕎麩皮黃酮的CAA值分別為（32.9±3.2）μmol QE/100 g和（30.9±2.2 ）μmol QE/100g在PBS清洗和不清洗處理中，T1和T2的CAA值并無顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 苦蕎麩皮黃酮的細胞抗增殖活性

用不同質(zhì)量濃度的T1和T2苦蕎麩皮黃酮培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2，72 h后檢測其抗增殖活性。T1和T2苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞的生長抑制作用見圖3。

圖3 兩種苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞抗增殖及毒性作用（ ±s,n=3）Fig.3 Antiproliferative and cytotoxic effects of flavonoids extracted from T1 and T2 tartary buckwheat brans on HepG2 cells ( ±s, n =3)

由圖3可知，黃酮在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，能顯著抑制HepG2細胞增殖且表現(xiàn)出量效關系。與對照組相比，T1苦蕎麩皮黃酮的質(zhì)量濃度為12.5 mg/mL時，即能顯著抑制HepG2細胞的增殖(P＜0.01)，但當T1苦蕎麩皮黃酮質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，其細胞抗增殖活性則是由細胞毒性引起的，在無細胞毒性質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，T1苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞的抑制作用為73.3%～49.0%；T2苦蕎麩皮黃酮的質(zhì)量濃度為9.4 mg/mL時，即能顯著抑制HepG2細胞的增殖（P＜0.01），但當T2苦蕎麩皮黃酮質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，其細胞抗增殖活性則是由細胞毒性引起的，在無細胞毒性質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，T2苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞的抑制作用為55.1%～18.3%。因此，T1和T2苦蕎麩皮黃酮在無細胞毒性作用時，能顯著抑制人肝癌細胞HepG2的細胞增殖。

T1、T2苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞生長抑制的EC50值見表3，此處的EC50值意為當抑制細胞增殖率為50%時，所需樣品的質(zhì)量濃度值。EC50值越低，則樣品的抗增殖活性越強。

由表3知，T2苦蕎麩皮黃酮的EC50值明顯小于T1（P＜0.01）。即與T1相比，T2苦蕎麩皮黃酮具有更強的抗腫瘤細胞增殖的活性（P＜0.01）。

表3 兩種苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞生長抑制的EECC50及毒性（ ±s, n=3）Table 3 EC50 Values of flavonoids extracted from T1 and T2 tartary buckwheat brans in antiproliferative activity assay and their cytotoxic concentrations ( ±s, n =3)

表3 兩種苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞生長抑制的EECC50及毒性（ ±s, n=3）Table 3 EC50 Values of flavonoids extracted from T1 and T2 tartary buckwheat brans in antiproliferative activity assay and their cytotoxic concentrations ( ±s, n =3)

注：**.與T1相比，差異極顯著（P＜0.01）。

種類 EC50/（mg/mL） 毒性質(zhì)量濃度/（mg/mL)T1 23.0±0.5 25 T2 13.7±0.1** 25

3 討 論

對于苦蕎麩皮黃酮類化合物抗氧化性的研究，目前主要采用化學分析法研究其體外抗氧化活性[8,13,16]，但通過細胞模型來評價苦蕎麩皮黃酮抗氧化性的研究則鮮有報道。細胞抗氧化方法比化學分析法更能反映樣品抗氧化的功能特性[21-22]。

為了更全面的反映苦蕎麩皮的細胞抗氧化能力，本實驗采用PBS清洗和不經(jīng)PBS清洗兩種操作，其中PBS清洗實驗主要反映在HepG2細胞內(nèi)抗氧化劑的抗氧化性；不經(jīng)PBS清洗實驗則主要反映包括HepG2細胞膜表面在內(nèi)的抗氧化劑的抗氧化性。研究發(fā)現(xiàn)，在PBS清洗實驗中，苦蕎麩皮T1和T2黃酮的CAA值分別為（44.4±5.2）μmol QE/100 g和（52.5±2.7）μmol QE/100 g；在不經(jīng)PBS清洗處理中，T1和T2苦蕎麩皮黃酮的CAA值分別為（32.9±3.2）μmol QE/100 g和（30.9±2.2）μmol QE/100 g。研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎麩皮黃酮類化合物主要組成為蘆丁、槲皮素、異槲皮素、槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、葒草素、異葒草素、牡荊素和異牡荊素[14,25-27]。其中，槲皮素、兒茶素及表兒茶素均具有很強的細胞抗氧化活性[26]。此外，黃酮類化合物的細胞抗氧化性主要取決于黃酮化合物的結構以及黃酮化合物糖基化或羥基化的程度[26]。T1和T2苦蕎麩皮黃酮的細胞抗氧化活性可能是由其所含的某一種黃酮類化合物，如兒茶素、槲皮素等發(fā)揮細胞抗氧化活性，也可能是由其黃酮類化合物的協(xié)同作用而顯示細胞抗氧化活性。

黃酮類化合物在抑制不同腫瘤細胞增殖時，表現(xiàn)出不同的抑制機理。研究表明Bcl-2和Bax是重要的細胞凋亡調(diào)控蛋白，Bcl-2大量表達時細胞凋亡減少，而Bax蛋白大量表達時則引起細胞凋亡的加速[28]。對于人食管癌EC9706細胞和宮頸癌HeLa細胞而言，苦蕎黃酮可減少其Bcl-2的表達量，而使Bax的表達量增多，即苦蕎黃酮可能通過誘導人食管癌EC9706和宮頸癌HeLa細胞凋亡來達到抑制細胞增殖的作用，此外，苦蕎黃酮可抑制白血病細胞株HL-60的生長并誘導其凋亡[29]。本項研究表明，在不產(chǎn)生細胞毒性的濃度范圍內(nèi)，T1和T2苦蕎麩皮黃酮提取物對人肝癌細胞HepG2的增殖具有一定的抑制作用，且T2苦蕎麩皮黃酮對HepG2細胞的增殖抑制作用明顯強于T1（P＜0.01）。因此，可選擇將苦蕎麩皮黃酮作為抗腫瘤藥物研發(fā)以及功能性食品開發(fā)的原料資源。

4 結 論

苦蕎麩皮作為苦蕎面粉加工時的副產(chǎn)物，在蕎麥類制品加工過程中并未得到人們的重視，本實驗通過細胞模型評價了產(chǎn)自重慶酉陽（T1）和四川西昌（T2）的苦蕎麩皮黃酮類化合物的抗氧化性及其抑制人肝癌細胞HepG2增殖的能力。結果表明：T1和T2苦蕎麩皮黃酮具有一定的抗氧化性，并且在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，T1和T2苦蕎麩皮黃酮的細胞抗氧化活性表現(xiàn)出時效關系；在抗增殖實驗中，T1和T2苦蕎麩皮黃酮在無細胞毒性的濃度范圍內(nèi)，能顯著抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，并表現(xiàn)出量效關系。

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