吳道勛，劉 璐，王 瑩，劉 熙，張海珠*

（1.大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)學研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

云南松松塔中原兒茶酸提取工藝的研究

吳道勛1，2，劉 璐1，2，王 瑩1，2，劉 熙1，2，張海珠1，2*

（1.大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)學研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

目的：優(yōu)化云南松松塔中原兒茶酸的提取工藝。方法：以不同溶劑對云南松松塔中原兒茶酸的提取效率為指標，用高效液相色譜法進行含量測定，采用L9（34）正交設計試驗以確定最佳提取工藝。結果：最佳提取工藝：以乙酸乙酯為提取溶劑，加入0.1 mol/L的HCl 3 mL，料液比為1∶40（mg/mL），超聲時間90 min，超聲溫度40℃。結論：優(yōu)化后的提取工藝簡單、穩(wěn)定、提取率高。

云南松；松塔；原兒茶酸；正交試驗

松塔（Pinecone）系松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的球果，別名松實、松元、松果、松球，其植物來源有華山松、云南松、紅松、油松及思茅松等〔1〕，松塔提取物具有抗腫瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、增強免疫力等功效〔2〕，而分布在云南的云南松（Pinus yunnanensis Faranch）資源十分廣泛，其松塔主要被當做燃料使用。

現(xiàn)代藥理實驗表明，原兒茶酸具有抑制黑色素生成的作用〔3〕、對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用〔4〕等多種藥理活性。文獻報道云南松松塔中含有原兒茶酸〔5〕，且云南松分布廣泛，因此選擇松塔為試材對云南松松塔中原兒茶酸的提取工藝進行考察研究，以期為云南松松塔藥材的開發(fā)利用及原兒茶酸的來源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AL104電子分析天平（梅特勒一托利多儀器有限公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000（上海亞榮生化儀器廠）。

1.1.3 主要試劑 原兒茶酸對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-11103006）；流動相甲醇為色譜純（Merck公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取原兒茶酸對照品4.957 mg，置于5 mL容量瓶中，加濃度為甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，得濃度為0.995 mg/mL的對照品儲備液。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取松塔粉末1.0 g置于100 mL具塞錐形瓶中，加入0.1 mol/L的HCl 3 mL，20 mL乙酸乙酯，超聲溫度40℃，超聲時間60 min，過濾，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，殘渣用甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.3 色譜條件 Phenomenex Gemini C18（250× 4.60 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-0.1%磷酸水溶液（11∶89，V/V）為流動相；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長298 nm，進樣量10 μL。見圖1。

圖1 云南松松塔樣品、原兒茶酸對照品色譜圖

1.2.4 標準曲線的繪制 分別精密量取對照品儲備液0.1，0.15，0.2，0.3，0.35，0.4 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得梯度對照品溶液，用高效液相色譜儀測定其峰面積，進樣量10 μL。以對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸計算，得到回歸方程Y=1 110X-43.011，r=0.999 9。測定結果顯示，原兒茶酸在9.95～39.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

后來，我又專門找了張三爺?shù)暮筝厒魅藛栠^，得知他們所練的功夫叫“三皇功”，又叫“內(nèi)八卦”，但是與八卦掌和三皇炮錘風格迥異，而他也不愿意公開演練，所以張三爺?shù)摹叭使Α币廊皇莻€謎。

1.2.5 方法學考察 精密度試驗結果RSD為0.60%。

稱取松塔粉末6份（過60目篩，1.0 g），按照“1.2.2”項方法進行操作，得到重復性試驗樣品中原兒茶酸的平均含量為131.93 μg/g，RSD為0.65%。

穩(wěn)定性試驗，每隔4 h測定樣品液，連續(xù)考察24 h，RSD為1.1%。

回收率試驗顯示，所測樣品回收率平均值為99.03%，RSD為0.6%。見表1。

方法學考察結果顯示本測定方法精密度、重復性、穩(wěn)定性、回收率良好，樣品液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，該方法適用于云南松松塔中原兒茶酸的提取及含量測定。

表1 加樣回收率實驗結果

2 云南松松塔中原兒茶酸的提取工藝研究

2.1 工藝篩選 以乙酸乙酯作為提取溶劑，采用L9（34）正交試驗設計，對料液比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、HCl濃度（D）的不同水平進行考察，見表2。稱取松塔粉末9份（過60目篩，1.0 g），按L9（34）實驗安排。見表3。制備樣品9份，過濾，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，殘渣用甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜過濾，進樣量10 μL，用高效液相色譜儀測定含量并進行方差分析。見表4。

表2 因素水平表

表3 正交試驗安排及結果

表4 方差分析

經(jīng)方差分析可知，各因素對提取效率的影響大小順序為：A＞B＞C＞D，即料液比為主要影響因素，超聲時間次之，其中HCl濃度對結果影響較小。同時，方差分析也表明超聲時間與料液比對結果有顯著意義。綜合分析表明，云南松松塔中原兒茶酸的最佳提取工藝為A3B3C2D1。

2.2 驗證試驗 按正交試驗結果，稱取云南松松塔粉末4份（過60目篩，1.0 g）置于100 mL具塞錐形瓶中，精密稱定，加入0.1 mol/L的HCl 3mL，40 mL乙酸乙酯，超聲溫度40℃，超聲時間90 min，過濾，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，殘渣用甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻。照“1.2.3”項下色譜條件測定并計算含量。見表5。

表5 樣品含量測定

3 結論與討論

3.1 提取溶劑的選擇 比較了水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯4種提取溶劑，發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯作為提取溶劑，采用加熱超聲提取的效果最佳，提取效率最高且雜質(zhì)干擾少〔6〕。同時，確定了云南松松塔中原兒茶酸的最佳提取工藝：以乙酸乙酯為提取溶劑，加入0.1 mol/L的HCl 3 mL，料液比為1∶40（mg/mL），超聲時間90 min，超聲溫度40℃，24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.2 流動相的選擇 文獻中〔7-10〕流動相多采用乙腈-冰醋酸、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸、乙腈-磷酸二氫銨等系統(tǒng)，但乙腈價格較昂貴，本試驗中將流動相優(yōu)化以甲醇-磷酸（11∶89，V/V），分離效果良好，且價格低廉，實用性強。

優(yōu)化后的提取工藝簡單、穩(wěn)定、提取率高，該工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)，為云南松松塔中原兒茶酸的提取提供了依據(jù)，所以本實驗的研究具有一定的實用意義。

〔1〕嚴文靜，李春艷，楊永壽，等.不同采摘時間云南松松塔中脫氫樅酸的HPLC法測定〔J〕.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（8）：798-800.

〔2〕施貴榮，李冬梅，楊靜，等.思茅松松塔化學成分的初步研究〔J〕.大理學院學報，2013，12（9）：4-6.

〔3〕楊關花，石艷，李智聰，等.原兒茶酸對小鼠黑色素瘤B16細胞酪氨酸酶活力及黑色素生成的抑制效應〔J〕.廈門大學學報，2013，52（6）：842-845.

〔4〕李智勇，夏鷹，陳曉東，等.益智仁提取物原兒茶酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.海南醫(yī)學，2013，24（2）：157-159.

〔5〕李寅珊，李冬梅，蔣凌云，等.云南松松塔的化學成分〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012，2（18）：119-121.

〔6〕張麗，馮鋒，柳文媛.HPLC法測定不同產(chǎn)地虎耳草中沒食子酸、原兒茶酸和虎耳草素的含量〔J〕.西北藥學雜志，2011，2（26）：88-90.

〔7〕丁小娟，丁珊珊，呂凌，等.HPLC法同時測定宣木瓜中五種有機酸和原兒茶酸的含量〔J〕.安徽醫(yī)藥，2013，17（9）：1496-1497.

〔8〕劉艷妮，李慧敏，徐融，等.不同產(chǎn)地山茱萸中4種活性成分含量的HPLC分析〔J〕.植物資源與環(huán)境學報，2013，22（2）：108-110.

〔9〕黎強，張曉娟，羅玲.高效液相色譜法同時測定盆炎凈片中原兒茶酸、咖啡酸和芍藥苷含量〔J〕.中國藥業(yè)，2012， 21（11）：26-27.

〔10〕趙嚴麗，曾奇風.高效液相色譜法測定田七痛經(jīng)膠囊中原兒茶酸含量〔J〕.中國藥業(yè)，2013，22（3）：1-12.

*通信作者：張海珠，講師.

（責任編輯 李 楊）

Extraction Process of Protocatechuic Acid in the Pinecone of Pinus yunnanensis

WU Daoxun1，2，LIU Lu1，2，WANG Ying1，2，LIU Xi1，2，ZHANG Haizhu1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To optimize the extraction process of the pinecone of protocatechuic acid in Pinus yunnanensis.Methods：Different solvents were used to extract protocatechuic acid in Pinus yunnanensis.Their extraction efficiency was taking as index；content was determined by using HPLC chromatography.Finally，L9（34）orthogonal design experiment was used to determine the optimum the extraction process.Results：The optimum extraction process：with ethyl acetate as the extraction solvent，0.1 mol/L HCl 3 mL was added into it.Material-liquid ratio was 1∶40（mg/mL）；ultrasonic time 90 min；ultrasonic temperature 40℃.Conclusion：The Optimized extraction process is simple，stable and have high extraction rate.

Pinus yunnanensis Faranch；pinecone；protocatechuic acid；orthogonal test

R284

A

1672-2345（2014）04-0004-03

10.3969/j.issn.1672-2345.2014.04.002

國家自然科學基金資助項目（81260632）

2014-01-02

2014-03-18

吳道勛，藥學專業(yè)2010級本科生.