趙得銀，劉 斌，曹志新，謝文濤，司小毛，方鯤鵬

Bax/Bcl-2、IFABP及D-D在大鼠急性腸系膜上靜脈血栓形成后表達(dá)及意義

趙得銀1，2，劉 斌1，曹志新1，謝文濤1，司小毛1，方鯤鵬1

目的研究大鼠急性腸系膜上靜脈血栓形成（ASMVT）后受累小腸在不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)改變及其細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)和相應(yīng)時(shí)點(diǎn)血清腸脂肪酸結(jié)合蛋白（IFABP）及D-二聚體（D-D）作為ASMVT后小腸病理改變及病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)。方法72只成年雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組。于建模后30 min，1、2、4h取病變腸段觀察病理改變、檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，同時(shí)測(cè)血清IFABP、D-D值。結(jié)果與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠檢測(cè)腸Bcl-2和Bax表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；Bax/Bcl-2顯著升高（P＜0.05）；與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IFABP和D-D濃度均顯著升高（P＜0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)增加顯著。結(jié)論ASMVT后受累小腸在不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)改變及Bax/Bcl-2的表達(dá)，結(jié)合相應(yīng)時(shí)點(diǎn)血清IFABP及D-D，可以診斷和監(jiān)測(cè)ASMVT的病情。

Bcl-2；Bax；腸脂肪酸結(jié)合蛋白；D-二聚體；急性腸系膜上靜脈血栓形成

急性腸系膜上靜脈血栓形成（acute superior mesenteric venous thrombosis，ASMVT）是一種少見(jiàn)的急腹癥，占整個(gè)腸缺血性疾病的6%～9%［1］。其病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，早期診斷難，易被誤診和漏診；目前臨床上缺乏快速而準(zhǔn)確的診斷及病情判斷指標(biāo)。該研究試圖通過(guò)分析大鼠ASMVT后受累小腸在不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)改變及其細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)，結(jié)合檢測(cè)相應(yīng)時(shí)點(diǎn)血清腸脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，IFABP）及D-二聚體（D-dimer，D-D）濃度，探討ASMVT后不同時(shí)間小腸病理改變及監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD雄性大鼠72只，體重365～450（405±18）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥品、試劑與儀器IFABP酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒、Bcl-2、Bax一抗、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型制備 72只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組，每組24只。各組內(nèi)再隨機(jī)分成建模后30 min組、建模后1h組、建模后2h組、建模后4h組，每組6只。所有大鼠術(shù)前禁食12h，不禁水，稱重后10%水合氯醛（0.3 ml/100 mg）腹腔注射麻醉。備皮后固定于手術(shù)臺(tái)，術(shù)野75%乙醇溶液消毒，腹部正中線開(kāi)腹。對(duì)照組，僅在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采血及切取腸組織。假手術(shù)組，僅麻醉后開(kāi)腹顯露腸系膜上靜脈主干。實(shí)驗(yàn)組，采取扎閉腸系膜上靜脈主干方法建立急性腸系膜上靜脈血栓的模型［2－3］。各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采集血液樣本及切取病變腸段的腸管，對(duì)照組及假手術(shù)組切取與實(shí)驗(yàn)組大鼠相應(yīng)的腸段。

1.3.2 血清IFABP及D-D測(cè)定 分別于實(shí)驗(yàn)組建模后30 min，1、2、4h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠抽取血液樣本，所有血樣本用離心機(jī)離心10 min（3 000 r/min）取上清液。D-D檢測(cè)立即送檢，應(yīng)用全自動(dòng)凝血分析儀測(cè)定。血清IFABP樣本于離心后取血清－80℃保存，1周內(nèi)檢測(cè)。

1.3.3 病理形態(tài)學(xué)觀察 各組所有大鼠采集血樣本后立即切取病變腸段（回腸段約5 cm），清洗腸腔后10%福爾馬林固定（對(duì)照組和假手術(shù)組取與實(shí)驗(yàn)組病變腸段相應(yīng)的腸段）。脫水后石蠟包埋，切片厚度為3 μm。常規(guī)HE染色后，在40倍顯微鏡下觀察回腸病理形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)Bcl-2、Bax表達(dá) 采用鏈酶親和素－生物素－復(fù)合物法（SABC三步法）檢測(cè)，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色。各時(shí)間點(diǎn)從每組隨意選取6張切片，每張切片在高倍顯微鏡下任意選擇3個(gè)視野進(jìn)行圖像分析。圖像分析采用Image-Pro Plus 6.0分析測(cè)量圖像軟件，分別測(cè)定Bcl-2和Bax的平均吸光度值，以平均吸光度作為Bax、Bcl-2基因蛋白表達(dá)水平的半定量參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腸管切片常規(guī)HE染色觀察對(duì)照組大鼠腸壁全層細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清楚。假手術(shù)組部分大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞輕度水腫，無(wú)明顯黏膜脫落，實(shí)驗(yàn)組大鼠建模后30 min即可見(jiàn)腸黏膜層淤血，腺體擴(kuò)張，少量黏膜破壞、脫落，腸系膜靜脈淤血擴(kuò)張，未見(jiàn)明顯血栓。建模后1h可見(jiàn)腸絨毛排列紊亂，部分脫落，腺體擴(kuò)張，絨毛及腺體周圍少量出血，系膜血管內(nèi)仍未見(jiàn)明顯血栓形成。建模后2h，腸黏膜上皮破壞進(jìn)一步加重，脫落明顯，絨毛及腺體周圍出血增加，少部分大鼠小腸系膜血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成。建模后4h，大鼠腸管擴(kuò)張變薄，腸黏膜上皮脫落明顯，正常絨毛結(jié)構(gòu)少見(jiàn)，腺體破壞、減少，黏膜層及黏膜下層亦可見(jiàn)明顯出血，部分肌層壞死明顯，甚至全層壞死，系膜血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成。

2.2 免疫組化法檢測(cè)Bax、Bcl-2的表達(dá)情況在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠腸管Bax、Bcl-2表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），假手術(shù)組則較對(duì)照組略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 對(duì)照組、假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組大鼠腸Bcl-2、Bax表達(dá)情況比較（n＝24，±s）

表1 對(duì)照組、假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組大鼠腸Bcl-2、Bax表達(dá)情況比較（n＝24，±s）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與假手術(shù)組比較：＃P＜0.05

組別建模后30 min BaxBcl-2Bax/Bcl-2建模后1h BaxBcl-2Bax/Bcl-2建模后2h BaxBcl-2Bax/Bcl-2建模后4h BaxBcl-2Bax/Bcl-2對(duì)照0.075±0.0070.198±0.0330.3790.085±0.0110.175±0.0430.4860.080±0.0100.184±0.0350.4350.077±0.0110.192±0.0350.401假手術(shù)0.084±0.0090.196±0.0300.4290.087±0.0120.203±0.0310.4290.085±0.0120.207±0.0260.4110.086±0.0150.195±0.0280.441實(shí)驗(yàn)0.285±0.038*＃0.473±0.062*＃0.603*＃0.331±0.039*＃0.451±0.066*＃0.734*＃0.389±0.060*＃0.396±0.064*＃0.982*＃0.218±0.050*＃0.248±0.048*＃0.879*＃

圖1 實(shí)驗(yàn)組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)回腸Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況 DAB×400

2.3 血清IFABP檢測(cè)對(duì)建模后30 min，1、2、4h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組組間分別比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IFABP較對(duì)照組和假手術(shù)組均顯著增加（P＜0.05），假手術(shù)組較對(duì)照組略有變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IFABP值比較（n＝24，pg/ml，±s）

表2 各組大鼠血清IFABP值比較（n＝24，pg/ml，±s）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與假手術(shù)組比較：＃P＜0.05

組別建模后30 min建模后1h建模后2h建模后4h對(duì)照29.59±5.2529.23±4.6127.71±4.7528.33±4.41假手術(shù)31.74±5.4833.49±5.6430.10±6.0332.81±6.47實(shí)驗(yàn)130.73±11.97*＃296.14±31.68*＃378.33±35.99*＃523.35±32.73*＃

2.4 血清D-D檢測(cè)對(duì)建模后30 min，1、2、4h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組組間分別比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清D-D較對(duì)照組和假手術(shù)組均顯著增加（P＜0.05），假手術(shù)組較對(duì)照組略有變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清D-D值比較（n＝24，mg/L，±s）

表3 各組大鼠血清D-D值比較（n＝24，mg/L，±s）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與假手術(shù)組比較：＃P＜0.05

組別建模后30 min建模后1h建模后2h建模后4h對(duì)照0.30±0.090.35±0.100.33±0.100.32±0.12假手術(shù)0.33±0.120.35±0.100.37±0.120.40±0.13實(shí)驗(yàn)1.07±0.31*＃1.12±0.32*＃1.31±0.31*＃1.67±0.26*＃

3 討論

ASMVT后腸道會(huì)發(fā)生淤血及缺血性改變［2，4］，缺血可導(dǎo)致腸黏膜水腫、充血，進(jìn)一步發(fā)展可出現(xiàn)黏膜出血、壞死及脫落，嚴(yán)重情況下可出現(xiàn)腸壁壞死、腸腔出血，整個(gè)過(guò)程都有細(xì)胞凋亡參與。通過(guò)檢測(cè)大鼠ASMVT后腸組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，可以反映大鼠腸管缺血情況。Bcl-2/Bax的比值決定著細(xì)胞在受到凋亡刺激后的生存與凋亡［5－6］。Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白過(guò)量表達(dá)，Bcl-2/Bax下降則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，否則反之。本研究顯示Bax、Bcl-2在對(duì)照組大鼠腸管組織呈低表達(dá)，假手術(shù)組較對(duì)照組表達(dá)變化不明顯；實(shí)驗(yàn)組大鼠在結(jié)扎腸系膜上靜脈后30 min，1、2h，Bax、Bcl-2表達(dá)較對(duì)照組及假手術(shù)組明顯升高，Bcl-2隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)呈下降趨勢(shì)，Bax/Bcl-2比值則明顯升高，說(shuō)明大鼠腸上皮細(xì)胞向著凋亡方向發(fā)展。建模后4h，Bax、Bcl-2表達(dá)均較之前明顯下降，分析原因可能為腸系膜上靜脈結(jié)扎后4h大鼠腸管明顯壞死，黏膜脫落，腺體變少，肌層出血壞死，腸管擴(kuò)張變薄有關(guān)，因此雖然實(shí)際細(xì)胞凋亡增加，但免疫組化檢測(cè)值下降。

IFABP在正常人群的血液和尿液中難于檢出，而小腸缺血早期患者的血清和尿液中IFABP升高，特別是腸系膜梗死患者升高更為顯著。Kanda et al［7］研究認(rèn)為幾乎所有急腹癥患者都會(huì)出現(xiàn)IFABP升高，但是小腸缺血性疾病明顯高于非缺血性疾病。本研究中在各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IFABP濃度比對(duì)照組和假手術(shù)組均明顯升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)增加。說(shuō)明大鼠腸淤血及缺血后IFABP釋放增加且病變程度越重，其在血清中濃度越高。提示IFABP在ASMVT疾病時(shí)，早期血清即有明顯變化，且檢測(cè)值越高提示病變嚴(yán)重程度越高。

D-D是纖維蛋白降解后一種特異性終產(chǎn)物，可以反映體內(nèi)凝血和纖溶的變化過(guò)程，對(duì)血栓性疾病的診斷有重要意義［8］。其異常增高與血栓疾病，如肺栓塞、深靜脈血栓形成、彌漫性血管內(nèi)凝血等關(guān)系已有較多的研究，臨床上常用于靜脈血栓的排除性診斷。Altinyollar et al［9］進(jìn)行動(dòng)物研究提示血漿DD可作為早期診斷急性腸系膜缺血的標(biāo)志物。有研究［10］顯示腸系膜靜脈血栓性疾病者血漿D-D均明顯高于正常值。本研究進(jìn)一步證實(shí)對(duì)照組大鼠D-D值均處于低水平，假手術(shù)組大鼠D-D值隨開(kāi)腹時(shí)間延長(zhǎng)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組D-D隨時(shí)間延長(zhǎng)有明顯升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)濃度持續(xù)升高。因此，本研究提示D-D值變化能反映大鼠體內(nèi)血栓形成及嚴(yán)重程度、發(fā)展變化趨勢(shì)。

綜上所述，本研究通過(guò)結(jié)扎法建立大鼠ASMVT模型，研究受累腸管細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)，結(jié)合相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血清IFABP、D-D指標(biāo)，對(duì)ASMVT的及早診斷及受累腸管的病理改變程度的判斷有一定的臨床借鑒意義。

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The expression and significance of Bax/Bcl-2，IFABP and D-dimer after acute superior mesenteric venous thrombosis in rats

Zhao Deyin1，2，Liu Bin1，Cao Zhixin1，et al
（1Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of General Surgery，The Suzhou Municipal Hospital，Suzhou 234000）

ObjectiveTo study the significance of pathological changes and expression of apoptosis-related proteins Bax/Bcl-2，combined with the values of serum intestinal fatty acid binding protein（IFABP）and D-dimer（D-D）in different time after acute superior mesenteric venous thrombosis（ASMVT）in rats.Methods72 SD adult male rats were randomly divided into control group，sham-operation group and model group.The small intestine was cut partly to observe pathological changes and detect the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax after modeling for 30 minutes，1，2，4hours，respectively；meanwhile，IFABP and D-D serum values were also detected respectively.ResultsIn model group，the expression of Bcl-2 and Bax was significantly increased（P＜0.05）；Bax/Bcl-2 increased significantly（P＜0.05）；the concentration of serum IFABP and D-D was significantlyhigher（P＜0.05）.ConclusionThe study suggests that pathological changes and the expression of Bax/Bcl-2 in intestinal combined with the serum IFABP and D-D after ASMVT can be used to diagnose and monitor ASMVT.

Bcl-2；Bax；intestinal fatty acid binding protein；D-dimer；acute superior mesenteric venous thrombosis

R 572.3

A

1000－1492（2014）04－0451－04

2013－12－20接收

安徽省教育廳自然科學(xué)基金（編號(hào)：2006KJ375B）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，合肥 230022

2宿州市立醫(yī)院普通外科，宿州 234000

趙得銀，男，主治醫(yī)師，碩士研究生；劉 斌，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：anyiliubin＠qq.com