王 麗，丁圣剛，李忠強(qiáng)，王亞亭

stim1和orai1蛋白在哮喘大鼠支氣管平滑肌中的表達(dá)

王 麗1，丁圣剛1，李忠強(qiáng)2，王亞亭1

目的研究基質(zhì)交感分子1（stim1）和鈣離子釋放激活鈣離子通道蛋白1（orai1）在哮喘氣道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)水平的變化。方法選取40只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和哮喘組，其中哮喘組用雞卵清蛋白（OVA）激發(fā)制備大鼠哮喘模型（n＝20），對(duì)照組用生理鹽水代替（n＝20）。肺組織病理切片HE染色判斷哮喘模型是否建立成功，分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)，應(yīng)用免疫組化技術(shù)及彩色病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)定stim1和orai1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值。結(jié)果肺組織病理切片HE染色鏡下觀察呈現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜腫脹，支氣管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓等，證實(shí)哮喘模型建立成功。哮喘組中大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哮喘組大鼠支氣管平滑肌表達(dá)orai1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。哮喘組和對(duì)照組大鼠支氣管平滑肌表達(dá)stim1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論orai1蛋白在哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)變化較stim1蛋白明顯，對(duì)支氣管平滑肌調(diào)節(jié)作用可能更重要。

基質(zhì)交感分子1；orai1蛋白；哮喘；平滑肌細(xì)胞

鈣庫(kù)調(diào)控鈣離子內(nèi)流（store operated calcium entry，SOCE）在機(jī)體生理、病理活動(dòng)中起著重要作用，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、增殖與分化，同時(shí)與機(jī)體免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及結(jié)構(gòu)細(xì)胞發(fā)揮作用有密切關(guān)系［1－2］。鈣離子釋放激活鈣離子通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel protein 1，orai1）和基質(zhì)交感分子1（stromal interaction molecule l，stim1）是構(gòu)成SOCE的重要分子，orai1被公認(rèn)為介導(dǎo)SOCE通道中Ca2＋內(nèi)流的離子通道，stim1被認(rèn)為是胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2＋的“傳感器”，Ca2＋敏感區(qū)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）腔內(nèi)的EF-hand結(jié)構(gòu)。支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體慢性炎癥和長(zhǎng)期免疫應(yīng)答反應(yīng)有密切關(guān)系。該研究旨在探討orai1蛋白在哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)變化，以期證實(shí)構(gòu)成SOCE的orai1和stim1與支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展存在的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠40只，清潔級(jí)，雄性，體重100～130 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑與儀器雞卵清蛋白（OVA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；氫氧化鋁粉購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；orai1和stim1一抗抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠哮喘模型的建立 參照文獻(xiàn)［3］方法，取清潔級(jí)SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組和哮喘組。哮喘組于第1、8、15天分別腹腔注射10%OVA溶液1 ml（含100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁）進(jìn)行致敏，對(duì)照組用生理鹽水代替腹腔注射；哮喘組于第16天起霧化吸入含有1%OVA生理鹽水1 ml，每次30 min，共7 d，激發(fā)哮喘，使其出現(xiàn)打噴嚏、喘息、呼吸急促或呼吸困難等表現(xiàn)；對(duì)照組用生理鹽水代替霧化吸入，吸入時(shí)間相同。

1.3.2 標(biāo)本的留取 最后一次霧化吸入后24h內(nèi)，用3%戊巴比妥（0.3 ml/100 g）腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉后行開(kāi)胸手術(shù)，分離周?chē)M織，充分暴露左右主支氣管，結(jié)扎右肺主支氣管，并切取右肺葉，置于裝有4%多聚甲醛溶液中充分浸末備用。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的留取 左肺予以生理鹽水3 ml灌洗，重復(fù)進(jìn)行3次，每次灌洗時(shí)間持續(xù)30 s，將回抽的灌洗液放入離心管，經(jīng)4℃1 000 r/min離心10 min，離心后棄去上清液，將沉淀細(xì)胞用Hanks液洗滌離心2次，棄去上清液，加入Hanks液吹打混勻制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液涂片經(jīng)HE染色后用改良牛氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板做細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.4 石蠟切片HE染色 將浸入4%甲醛溶液固定的新鮮肺組織，24h后制作蠟塊，后用切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5 μm。常規(guī)用脫蠟、乙醇梯度脫水，行HE染色，光鏡下觀察肺臟組織病變情況。

1.3.5 石蠟切片免疫組化 將肺組織切片放在90℃恒溫箱中烘烤10 min后，常規(guī)用脫蠟、乙醇梯度脫水，PBS沖洗后分別應(yīng)用orai1和stim1蛋白免疫組化試劑盒，羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體作為標(biāo)記二抗，依次按步驟選取比較完整的支氣管，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)表達(dá)orai1和stim1蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞，并隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，進(jìn)行彩色病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)定orai1和stim1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺部組織形態(tài)學(xué)觀察行HE染色后，鏡下觀察哮喘組大鼠肺臟組織，表現(xiàn)為支氣管黏膜腫脹，內(nèi)膜皺襞增多，部分上皮細(xì)胞破壞、脫落，杯狀細(xì)胞增生，平滑肌層增厚，管壁增厚，管腔狹窄，黏液分泌增多，可見(jiàn)黏液栓形成，管壁周?chē)?jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組則未見(jiàn)上述炎性改變，僅有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔內(nèi)少許分泌物。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠肺部組織表達(dá) HE×200

2.2 支氣管BALF涂片HE染色細(xì)胞計(jì)數(shù)兩組大鼠BALF中均含有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，與對(duì)照組比較，哮喘組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)（n＝20，±s）

表1 兩組大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)（n＝20，±s）

項(xiàng)目哮喘組對(duì)照組t值P值細(xì)胞總數(shù)（×106/L）110.70±27.5650.00±19.77 0.581 0.000中性粒細(xì)胞（×106/L）28.80±5.075.50±2.643.403 0.000嗜酸性粒細(xì)胞（×106/L）7.80±2.251.60±1.084.033 0.000

2.3 支氣管平滑肌orail和stim1表達(dá)與對(duì)照組相比，哮喘組大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞及其周?chē)M織均有orai1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，呈棕黃色顆粒，支氣管平滑肌細(xì)胞平均光密度值明顯升高（0.099±0.025 vs 0.072±0.014，P＜0.05）；哮喘組大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞及其周?chē)M織均有stim1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，呈棕黃色顆粒，支氣管平滑肌細(xì)胞的平均光密度值與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.093 ±0.025 vs 0.088±0.017，P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 orai1、stim1蛋白免疫組化檢測(cè)

3 討論

氣道平滑肌細(xì)胞是哮喘發(fā)作時(shí)氣道結(jié)構(gòu)變化的主要效應(yīng)細(xì)胞，被認(rèn)為是氣道高反應(yīng)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時(shí)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分也參與哮喘的慢性炎癥反應(yīng)。Baryshnikov et al［4］利用siRNA法敲除大鼠血管平滑肌細(xì)胞及人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的stim1和（或）orai1蛋白降低細(xì)胞的SOCE活性，明顯抑制平滑肌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流，進(jìn)而使中性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)活性降低，肥大細(xì)胞脫顆粒及釋放炎癥介質(zhì)減少，淋巴細(xì)胞克隆分化減弱［5－8］。

有研究［9］表明orai1和stim1兩種蛋白是構(gòu)成SOCE通路的重要組成部分，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下stim1和orai1蛋白分別均勻地分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞膜上，胞外激動(dòng)劑作用于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-linked receptor，GPCR）活化磷脂酶C（phospholipaseC，PLC）產(chǎn)生三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），IP3與細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)IP3受體（IP3 receptor， IP3R）結(jié)合，使鈣庫(kù)開(kāi)放，鈣庫(kù)迅速釋放Ca2＋流入胞質(zhì)，并出現(xiàn)鈣庫(kù)損耗狀態(tài)，stim1蛋白感受鈣庫(kù)的充盈狀態(tài)，stim1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上重新排列，在靠近細(xì)胞膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上聚集［10－11］，將細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭信號(hào)，傳遞給位于細(xì)胞膜上的orai1蛋白，orai1蛋白活化且表達(dá)增多，形成功能性鈣離子通道，促使胞外Ca2＋內(nèi)流。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還有兩個(gè)orai1的同源蛋白：orai2、orai3，在HEK293細(xì)胞研究［12］顯示所有的orai蛋白都能增加SOCE，其中orai1功效最強(qiáng)，且是構(gòu)成SOCE通道的重要組成部分，介導(dǎo)Ca2＋的內(nèi)流。本研究結(jié)果顯示哮喘組支氣管平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)orai1蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值明顯高于對(duì)照組，提示在哮喘發(fā)作時(shí)，氣道平滑肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使鈣庫(kù)開(kāi)放，并出現(xiàn)鈣庫(kù)耗竭，stim1作為胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2＋的“傳感器”，介導(dǎo)Ca2＋內(nèi)流的離子通道開(kāi)放，胞外Ca2＋流入胞內(nèi)，填充胞內(nèi)鈣庫(kù)，以維持氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)外鈣離子平衡及其收縮功能。利用RNA干擾技術(shù)沉默orail蛋白后可顯著抑制毒胡蘿卜素或環(huán)匹阿尼酸清空鈣庫(kù)引起的Ca2＋內(nèi)流，從而抑制平滑肌Ca2＋內(nèi)流，充分證實(shí)這一觀點(diǎn)［9］。

stim1被證明是細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的傳感器，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量。目前已發(fā)現(xiàn)stim分子有stim1和stim2兩種亞型［13－14］。stim1在SOCE通道活性中有重要作用，鈣庫(kù)排空之前stim1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，隨胞內(nèi)鈣庫(kù)排空，stim1在靠近細(xì)胞膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上以“斑”狀重新聚集［14－15］，Ca2＋敏感區(qū)EF-hand結(jié)構(gòu)域的基因突變，可能會(huì)降低其與Ca2＋的親和力，使stim1蛋白對(duì)未排空的鈣庫(kù)敏感，導(dǎo)致SOC非鈣庫(kù)調(diào)控的激活［4］。本研究結(jié)果顯示哮喘組支氣管平滑肌細(xì)胞表達(dá)stim1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，然而Potier et al［1］在研究細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在哮喘大鼠的氣道平滑肌細(xì)胞中stim1的表達(dá)較對(duì)照組大鼠的表達(dá)增多，所以stim1蛋白在氣道平滑肌細(xì)胞中作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，stim1和orai1蛋白作為SOCE通路的重要組成部分，在哮喘氣道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)水平的變化，可能對(duì)氣道平滑肌收縮功能起到重要作用，且orai1蛋白對(duì)支氣管平滑肌調(diào)節(jié)作用更重要，SOCE通道可能參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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The expression of stim1 and orai1 protein in asthmatic rats airway smooth muscle cells

Wang Li1，Ding Shenggang1，Li Zhongqiang2，et al
（1Dept of Pediatrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Pediatrics，Linyi City People′s Hospital，Linyi 276000）

ObjectiveTo investigate the changes of stim1 and orai1 protein in the level of expression in asthmatic airway smooth muscle cells.Methods40 SD rats were randomly divided into normal control group and asthma group，and asthma model was established by OVA sensitization in rats.HE staining of lung tissue to determine whether the asthma model successfully established.Cell counting and classification were obtained in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of rats，immunohistochemical detection and color graphic analysis system was used to measure the expression of stim1 and orai1 protein positive cells mean optical density value.ResultsThe lung tissue pathological section HE staining showed inflammatory cell infiltration，bronchial mucosal edema，bronchial visible mucus，confirmed the asthma model was established successfully.Compared with the normal control group，the total number of cells，neutrophils count，eosinophils count in BALF sediment of the asthma group were significantly increased，and the difference was statistically significant（P＜0.01）.The expression of orai1 protein positive cells mean optical density value of asthma group was significantlyhigher than the normal control group（P＜0.05）.Asthma group and normal control grouphad no significant difference in expression the stim1 protein positive cells in the average optical density value（P＞0.05）.ConclusionOrai1 proteins may play an important role in the contraction of asthma rat airway smooth muscle cells.

stim1；orai1；asthma；airway smooth muscle cells

R 562.25

A

1000－1492（2014）04－0430－04

2013－10－28接收

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

2臨沂市人民醫(yī)院兒科，臨沂 276000

王 麗，女，碩士研究生；王亞亭，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangyating1348＠126.com