李朋，蔡興奎，陳琳，柳俊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，國家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070)

遺傳育種

馬鈴薯體細胞雜種后代青枯病抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測

李朋，蔡興奎，陳琳，柳俊*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，國家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070)

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種毀滅性的細菌性土傳病害。馬鈴薯青枯病抗性資源主要存在于一些野生種中，體細胞雜交是創(chuàng)制馬鈴薯青枯病抗性資源的一種有效途徑。本研究以具有對青枯病抗性的體細胞雜種與栽培種雜交產(chǎn)生的100個后代為材料，對其進行青枯病抗性評價，旨在篩選可供育種利用的青枯病抗性資源。青枯病抗性鑒定結(jié)果表明，在試管苗組培鑒定中100個雜交后代共有6個基因型表型抗青枯病，溫室缽栽接種鑒定有8個基因型表現(xiàn)為抗病，在兩種接種鑒定中均表現(xiàn)為抗病的有3個基因型(07SF.3-79、07SF.6-8和07SF.6-5)。選用本實驗室前期篩選的與青枯病抗性相關(guān)的4對SSR標(biāo)記引物（STI0051、STI0054、STI0056、STI0057），對100個基因型進行分子標(biāo)記檢測，結(jié)果顯示，有3個標(biāo)記（STI0051.180、STI0054.180、STI0056.205）可以明確鑒定抗感基因型，它們表現(xiàn)為抗病穩(wěn)定的3個基因型的標(biāo)記位點與抗病對照的帶型一致，而在感病對照中缺失，與表型鑒定結(jié)果吻合，表明篩選的SSR標(biāo)記可以用于具有S.chacoense遺傳背景材料的青枯病抗性輔助選擇。

馬鈴薯；體細胞雜種；青枯病；抗性鑒定；分子標(biāo)記

馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的細菌性病害，由于細菌性病害的系統(tǒng)感染特性，導(dǎo)致其藥物防治十分困難[1]。而且，馬鈴薯栽培種又缺乏抗性資源，因此導(dǎo)致馬鈴薯青枯病抗病育種十分困難。20世紀(jì)30～60年代期間，美國測試了普通栽培種的上萬份品種和無性系，并未發(fā)現(xiàn)高抗青枯病的品種，只有少部分材料發(fā)病期比感病對照稍晚[2]。中國的研究人員也曾鑒定了育種單位選育的品種、高代無性系栽培種資源等400多份，結(jié)果顯示幾乎所有材料都表現(xiàn)中感或高感青枯病。因此，利用體細胞雜交獲得攜帶野生種的青枯病抗性的種質(zhì)資源是目前創(chuàng)制青枯病抗性資源的主要途徑。20世紀(jì)末至21世紀(jì)初，國內(nèi)外研究人員利用具有青枯病抗性的野生種與馬鈴薯栽培種進行體細胞雜交，獲得了大批具有青枯病抗性的體細胞雜種。Laferriere等[3]利用野生種S.commersonii與栽培種雙單倍體融合，再生的雜種植株其抗性水平顯著高于感病對照品種‘Atlantic’和‘Superior’。Fock等[4]利用原始栽培種S.phureja與栽培種雙單倍體進行融合，再生的體細胞雜種及其親本植株進行室內(nèi)青枯菌接種鑒定，結(jié)果表明，體細胞雜種植株對青枯菌生理小種1號和3號菌株均具有明顯的抗性，其中雜種株系BP9的抗性水平顯著高于抗性親本S.phureja。他們又利用S.stenotomum與栽培種融合也得到了類似的結(jié)果[5]。本實驗室蔡興奎等[6]利用來自S.chacoense的一個抗青枯病的無性系與栽培種進行體細胞雜交，也獲得了一批抗青枯病的體細胞雜種。然而，由于一些野生不良性狀的累贅，這些雜種還不能直接用于育種。在前期的研究中，郭鮮蒲[7]利用一個抗青枯病且可以正常開花的體細胞雜種3c28-1為親本，與栽培品種進行雜交成功并獲得雜種后代，但這些雜種后代是否仍然具有青枯病抗性還不清楚。本研究對這些雜種后代進行了系統(tǒng)的青枯病抗性評價，以期篩選出可用于青枯病抗性育種的親本材料。

1 材料與方法

1.1 材料

2007和2008年，3c28-1、3c35-3以及8c6-2與7個馬鈴薯四倍體栽培種優(yōu)良品系進行有性雜交。3c28-1、3c35-3選自S.chacoense和3#的體細胞雜種后代，8c6-2選自S.chacoense和8#的體細胞雜種后代，它們均具有對青枯病的抗性，3#和8#是馬鈴薯品種‘中薯2號’經(jīng)授粉誘導(dǎo)孤雌生殖產(chǎn)生的雙單倍體。實生種子在無菌條件下發(fā)芽獲得試管苗，獲得8個組合的后代共100個基因型，雜交組合及后代數(shù)量列于表1。

1.2 方法

1.2.1 試管苗組培條件下接種鑒定

青枯菌選用生理小種1號、生理小種3號。青枯菌培養(yǎng)基配制方法按照本實驗室青枯病菌培養(yǎng)操作指南進行（實驗室內(nèi)部資料未發(fā)表），涂皿后在37℃條件下培養(yǎng)48 h，用無菌水沖洗下菌株，使用紫外分光光度計測菌液濃度，稀釋至0.1 OD，即1×108個/mL的濃度用于接種。

表1 雜交組合及后代數(shù)Table 1Cross combinations and progenies

每個基因型按照馬鈴薯切段培養(yǎng)方法每盒接入9個節(jié)段，在每天光照16 h、溫度20℃的條件下培養(yǎng)3周，選用生長一致的試管苗4盒用于青枯病接種。接種使用手術(shù)刀片劃“#”傷根后3盒注入菌液5 mL，1盒注入等量無菌水作為對照。置于25± 1℃，光照16 h/d的培養(yǎng)室培養(yǎng)。接種后每天觀察發(fā)病情況，以抗病和感病對照差異最大（15 d左右）的時間點作為記錄發(fā)病表型判別的記錄時間。

1.2.2 試驗材料的缽栽接種鑒定

選取生長狀況良好的植株栽種于營養(yǎng)缽中，每個基因型栽種4缽，25℃溫室培養(yǎng)3周，3缽使用手術(shù)刀片傷根后加入10 mL稀釋后的菌液，1缽傷根后加入10 mL蒸餾水作為對照，白天氣溫控制在28℃左右，晚上保持在20℃以上，接種后每天觀察發(fā)病情況。當(dāng)抗病對照與感病對照出現(xiàn)差異時開始統(tǒng)計，統(tǒng)計方法及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)同室內(nèi)接種鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 青枯病抗性評價

青枯病抗性評價參照本實驗室前期建立的方法進行，根據(jù)發(fā)病情況分為0～4級：

0級為無葉片萎蔫；

1級為＜25%葉片萎蔫；

2級為25%～50%葉片萎蔫；

3級為50%～75%葉片萎蔫；

4級為75%以上葉片萎蔫。

基因型抗（感）病確定：

0.0～1.0為抗?。≧）；

1.0～2.0為中抗（MR）；

2.0～3.0為中感（MS）；

3.0～4.0為感?。⊿）。

基因型病情指數(shù)計算：

病情指數(shù)=Σ（每個病級的植株數(shù)×級別數(shù)）/總植株數(shù)×最高級別數(shù)。

1.2.4 分子標(biāo)記檢測

實驗采用前期實驗室已篩選的與青枯病抗性相關(guān)SSR標(biāo)記引物4對[7]，引物信息與擴增條件見表2。

DNA的抽提、PCR擴增、PAGE膠檢測等按照本實驗室分子操作指南進行。

表2 研究涉及的SSR引物信息Table 2SSR primers used in experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 體細胞雜種與栽培種雜交后代的青枯病抗性評價

2.1.1 組織培養(yǎng)條件下試管苗接種鑒定

接種采用前述的傷根法進行。對照基因型為體細胞雜種親本、體細胞雜種融合親本以及四倍體雜交親本共13個，其中體細胞雜種親本3c28-1、3c35-3、8c6-2以及野生種融合親本S.chacoence（cha）為抗病對照，395049.62、51-5、59-5-86、44-4、22-2、393160-4、03HE66-2以及體細胞融合親本3#和8#為感病對照。以抗病對

照與感病對照表現(xiàn)出最大差異時的發(fā)病情況作為評價時間點進行群體材料的抗病表型評價，試驗結(jié)果分析以三次獨立的生物學(xué)重復(fù)資料進行統(tǒng)計評價。

表3 體細胞雜種融合親本，抗青枯病體細胞雜種及其與四倍體馬鈴薯品系雜交后代的青枯病抗性評價Table 3Evaluation for resistance toR.solanacearumof somatic hybrid parents,resistant somatic hybrids and progenies derived from crosses between resistant somatic hybrids and tetraploid potato breeding lines

續(xù)表3

接種青枯病菌后觀察顯示，接種7 d后抗病對照與感病對照就開始出現(xiàn)表型的分化，感病材料出現(xiàn)下部葉片萎蔫，14 d后莖稈開始變黃脫水甚至整個植株死亡，而抗病對照萎蔫脫水現(xiàn)象都不明顯。從表3可以看出，9個感病對照在本研究接種條件下均表現(xiàn)為感病，其中以融合親本8#感病最嚴重，病情指數(shù)達到1。4個抗病對照均表現(xiàn)為抗病。來自8個組合的100個后代基因型的接種表型顯示，只有6個基因型表現(xiàn)出抗病，其中07SF.3-79和07SF.6-8表型為抗?。≧），07SF.6-5、07SF.13-29、07SF.13-40和07SF.3-75表現(xiàn)為中抗（MR），其余94個基因型均表現(xiàn)感?。ū?）。

2.1.2 溫室條件下缽載接種鑒定

體細胞雜種缽栽后，7～8葉時進行青枯病接種。接種青枯病菌后每天觀察發(fā)病情況，接種4 d后抗病對照與感病對照就開始出現(xiàn)表型的分化，感病基因型出現(xiàn)下部葉片萎蔫，植株有倒伏趨勢，7 d后植株開始變黃脫水萎蔫甚至整個植株死亡倒伏，而抗病對照萎蔫脫水現(xiàn)象并不明顯。從表3可以看出，9個感病對照在本研究中均表現(xiàn)為感病，4個抗病對照表現(xiàn)為抗病或中抗，其中野生種融合親本S.chacoence（cha）抗病性最強。雜種后代鑒定結(jié)果顯示，92個基因型表現(xiàn)為感病，只有8個基因型表現(xiàn)為抗病，它們是：表現(xiàn)抗病的07SF.3-76、07SF.3-79、07SF.6-5、07SF.6-8和07SF.3-9；表現(xiàn)中抗的07SF.1-55、07SF.2-47和07SF.6-6。

2.2 青枯病抗性分子標(biāo)記檢測

研究選用實驗室前期篩選的與青枯病抗性相關(guān)的4對SSR引物（STI0051、STI0054、STI0056和STI0057），對100個雜交后代及抗感親本和對照進行了PCR擴增，其中STI0051有1個符合參考文獻給定的分子量范圍的目標(biāo)帶，根據(jù)相對分子量命名該標(biāo)記為STI0051.180；STI0054、STI0056和STI0057均有2個符合分子量大小的目標(biāo)帶，根據(jù)相對分子量分別為STI0054.188、STI0054.180、STI0056.173、STI0056.205、STI0057.173、STI0057.180，即4對引物共產(chǎn)生7個標(biāo)記。根據(jù)7個標(biāo)記在所有基因型中的擴增結(jié)果分析顯示，100個雜種基因型共擴增有316個標(biāo)記位點，平均每個基因型3.16個。進一步分析顯示，標(biāo)記在基因型間的分布不均勻，有超過一半的基因型（57個）標(biāo)記位點數(shù)在2～4個之間，其余43個基因型中，有13個基因型標(biāo)記數(shù)最少（3個基因型未擴增出標(biāo)記帶，10個基因型只有一個標(biāo)記帶）。在20個標(biāo)記位點較多的基因型中，攜帶有全部7個標(biāo)記位點的基因型有2個（07SF.6-13、07SF.6-15），攜帶6個標(biāo)記位點的基因型有4個（07SF.1-43、07SF.4-17、07SF.4-29、07SF.13-26），另有14個基因型攜帶有5個標(biāo)記位點。

表43 個SSR標(biāo)記在抗感基因型中的帶型特征Table 4Band data of three SSR markers in resistant and susceptible genotypes

攜帶標(biāo)記位點數(shù)與抗病表型相關(guān)性分析顯示，二者之間并沒有顯著相關(guān)性。單個標(biāo)記與抗青枯病相關(guān)分析也沒有發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)的標(biāo)記。但將表現(xiàn)抗病穩(wěn)定的3個基因型的標(biāo)記位點與抗感基因型標(biāo)記特征分析發(fā)現(xiàn)，有3個標(biāo)記在3個抗病基因型中的帶型與抗病對照一致，而與感病對照相反。標(biāo)記STI0051.180，在抗病基因型中表型為有帶，在感病基因型中表現(xiàn)為無帶，3個雜種基因型均表現(xiàn)有帶。STI0054.180和STI0056.205在抗病基因型中均表現(xiàn)無帶，除STI0054.180在感病基因型22-2中也表現(xiàn)無帶外，在其它感病基因型中均表現(xiàn)有帶，3個抗病雜種基因型均表現(xiàn)無帶（表4）。

3 討論

本研究同時采用試管苗組培條件下接種和溫室缽栽傷根接種方法鑒定了100個體細胞雜種與栽培種的雜交后代基因型的青枯病抗性。從整體看，體細胞雜種后代大部分基因型為感病基因型，兩種鑒定方法共有11個基因型表現(xiàn)出不同程度的抗病性，其中，組培條件下鑒定有6個基因型表現(xiàn)不同程度的抗病性，缽栽傷根接種有8個基因型表現(xiàn)為抗病，兩種鑒定方法均表現(xiàn)為抗病的只有3個基因型（07SF.3-79、07SF.6-8和07SF.6-5）。進一步分析其余8個基因型的鑒定的結(jié)果顯示，其中有4個基因型均為中抗或者中感的差異，如07SF.1-55和07SF.6-6在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MS，在溫室條件下表現(xiàn)為MR；07SF.3-75和07SF.13-40在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MR，在溫室條件下表現(xiàn)為MS。另外4個基因型則至少在一個鑒定條件中表現(xiàn)為中抗或者中感，但在另一個條件下鑒定則偏向為抗或者感，如07SF.3-9和07SF.3-76，在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MS，但在溫室條件下表現(xiàn)為R；07SF.2-47在組培條件下鑒定表現(xiàn)為S，在溫室條件下表現(xiàn)為MR；07SF.13-29在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MR，在溫室條件下表現(xiàn)為S。上述結(jié)果表明，當(dāng)抗性級別較高時，無論采用何種方法鑒定，其表型相對穩(wěn)定，而處于中抗和中感水平時，其鑒定方法對表型影響較大。盡管如此，但從整體看，兩種接種方法的結(jié)果表型基本一致，因為占總數(shù)89%的感病基因型在兩種條件下的表型是基本一致的（表3）。

從本研究中還可以看出，盡管由于雜交的困難，每個組合獲得的后代數(shù)較少，但進一步分析顯示，雜交后代抗病性基因型在組合間存在差異。本研究中至少在一種條件下表現(xiàn)抗病的11個基因型來自5個組合，且抗病親本均為抗病性中等的體細胞雜種3c28-1；抗病親本為體細胞雜種8c6-2的組合，后代均表現(xiàn)感病。這一結(jié)果表明，雖然都是抗病體細胞雜種，但這種抗性傳遞給后代的能力存在差異，造成這種差異的原因可能與不同體細胞雜種的染色體整合程度、位置等有關(guān)，但目前還缺少這一領(lǐng)域的深入研究。

以表型為評價依據(jù)的病害接種鑒定具有直觀、試驗無需特殊復(fù)雜操作等優(yōu)點，但由于受環(huán)境控制難以完全一致的限制，會產(chǎn)生重復(fù)間結(jié)果不一致而影響判別。分子標(biāo)記反應(yīng)的是植物本身的遺傳基礎(chǔ)，采用分子標(biāo)記輔助進行病害鑒定是未來抗病育種的方向。本研究利用前期篩選的4個與青枯病抗性相關(guān)的標(biāo)記，對體細胞雜種與栽培種雜交產(chǎn)生的100個后代進行了檢測，結(jié)果顯示在3個抗性穩(wěn)定的基因型中，其帶型顯示與抗病對照和抗病親本一致，而與感病對照和感病親本相反。這一結(jié)果表明，利用分子標(biāo)記輔助鑒定抗病性是可能的。

[1]何禮遠,康耀衛(wèi).植物青枯菌(Pseudomonas solanacearum)致病機理[J].自然科學(xué)進展,1995,5:7-15.

[2]Nielsen L,Haynes F.Resistance in Solanum tuberosum to Pseudomonas solanacearum[J].Am J Pot Res,1960,37:260-267.

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[6]蔡興奎,柳俊,謝從華.馬鈴薯栽培種與野生種葉肉細胞融合及體細胞雜種鑒定[J].園藝學(xué)報,2004,31(5):623-626.

[7]郭鮮蒲.馬鈴薯體細胞雜種及其回交后代的遺傳穩(wěn)定性分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

Evaluation of Resistance and Associated Molecular Markers of Bacterial Wilt
of Potato Somatic Hybrid Offspring

LI Peng,CAI Xingkui,CHEN Lin,LIU Jun＊
(College of Life Sciences and Technology,Huazhong Agricultural University,Key Laboratory of Horticultural Plant Biology
(Huazhong Agricultural University),Ministry of Education,National Center for Vegetable Improvement
(Central China),Wuhan,Hubei 430070,China)

Ralstonia solanacearum,the causal pathogen of potato(Solanum tuberosum L.)bacterial wilt,is soil-borne and destructive for potato production.Somatic hybridization between S.tuberosum and wild relatives is an effective way to obtain germplasm possessing resistance to R.solanacearum.Evaluation of resistance to R.solanacearum on 100 progenies derived fromsomatichybridizationbetweenS.tuberosumandwildrelativeswereconductedinthisstudytoscreenforgermplasmsthat possessresistancetoR.solanacearumandarerelevanttobreeding.Theresultsshowedthatsixclonesexhibitedresistanceto the pathogen in vitro inoculation and eight clones performed resistance to the pathogen by the inoculation with greenhouse grownplantsamongthe100progenies.Noticeably,threeresistantclones(07SF.3-79,07SF.6-8and07SF.6-5)wereconsistent for resistance level in the two tests.Four SSRs(STI0051,STI0054,STI0056 and STI0057)previously identified were used to test all of the 100 clones mentioned above.The results demonstrated that three markers(STI0051.180,STI0054.180 and STI0056.205)could differentiate resistant genotype from susceptible ones.The three clones considered resistant in the two inoculations amplified the same bands as resistant control while they were absent in susceptible control.These were inaccordancewiththediseasephenotypingandsuggestanapplicationpotentialoftheseSSRsinmarker-assistantselectionof bacterialwiltresistanceintrogressedfromS.chacoense.

Solanum tuberosum;somatic hybrid;bacterial wilt;resistance evaluation;molecular marker

S532

A

1672－3635（2014）06-0321-07

2014-07-07

教育部創(chuàng)新團隊（IRT13065）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-10-P06）。

李朋（1989-），男，碩士研究生，研究方向為馬鈴薯生物技術(shù)育種。

柳俊，教授，研究方向為馬鈴薯生物技術(shù)育種，E-mail:liujun@mail.hzau.edu.cn。