符培亮 叢銳軍 張雷 丁 如 陳松 李林濤 許震宇 吳海山 吳宇黎

體外條件下 TGF-β3、BMP-2 和 DEX 誘導兔滑膜間充質干細胞向軟骨細胞譜系分化的研究

符培亮 叢銳軍 張雷 丁 如 陳松 李林濤 許震宇 吳海山 吳宇黎

目的本實驗擬將分離純化得到的滑膜間充質干細胞 ( synovial-derived mesenchymal stem cells，SMSCs ) 在體外培養(yǎng)條件下進行成軟骨刺激誘導，并從轉錄和翻譯兩個水平尋找進入軟骨細胞分化譜系的證據，進而判斷轉化生長因子 β3 ( transforming growth factor-β3，TGF-β3 )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 ( bone morphogenetic protein-2，BMP-2 ) 和地塞米松 ( dexamethasone，DEX ) 誘導 SMSCs 進入軟骨細胞分化譜系。方法貼壁法分離純化得到 SMSCs，在體外培養(yǎng)條件下用含 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基進行刺激誘導，并在倒置相差顯微鏡下觀察分化過程中其形態(tài)學的變化，以 RTPCR 檢測 I、II 型膠原及軟骨特異性 Aggrecan ( AGN ) 的 mRNA 表達，細胞免疫熒光化學染色的方法檢測細胞分化過程中 I、II 型膠原的表達，堿性甲苯胺藍細胞化學染色檢測軟骨特異性 GAG 的表達，證實 SMSCs 的誘導成軟骨作用。結果SMSCs 在前述誘導條件下，誘導后 14 天細胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切?、類軟骨細胞樣形態(tài)，RT-PCR 可以檢測到 I、II 型膠原及 AGN 基因的表達，細胞免疫熒光化學染色 I、II 型膠原、堿性甲苯胺藍細胞化學染色結果呈陽性。而未經誘導的 SMSCs 形態(tài)基本保持梭形，基因表達和染色呈陰性，兩組間差異顯著。細胞免疫熒光化學染色分析 SMSCs 在軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導后 14 天表達 I、II 型膠原；未經誘導的SMSCs 不表達 I、II 型膠原。說明 SMSCs 在軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導后 14 天進入軟骨細胞分化譜系，可作為種子細胞在同樣的誘導條件下向軟骨分化。結論SMSCs 作為新的 MSCs 家族成員，顯示出與 BMSCs 相似的多向分化潛能，500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 14 天，SMSCs已進入軟骨細胞分化譜系。SMSCs 可作為半月板組織工程的種子細胞。

間質干細胞；軟骨細胞；細胞轉分化；轉化生長因子

滑膜間充質干細胞 ( synovial-derived mesenchymal stem cells，SMSCs ) 經分離、純化、培養(yǎng)后，尚不能直接用作半月板組織工程的種子細胞，其原因在于 SMSCs 具有多向分化的潛能，在一定的誘導條件下可以分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞及骨骼肌細胞等[1-4]。為了促使已在體外分離并擴增的 SMSCs 向軟骨細胞譜系分化，尚需要特定的細胞因子對其進行刺激和誘導。

本實驗擬將分離純化得到的 SMSCs 在體外培養(yǎng)條件下用含 500 ng / ml BMP-2 ( bone morphogenetic proteins-2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 -2 )、10 ng / ml TGF-β3 ( transforming growth factor-β3 轉化生長因子 β3 )、10-7M DEX ( dexamethasone 地塞米松 ) 的高糖 DMEM培養(yǎng)基進行刺激誘導，并在倒置相差顯微鏡下觀察分化過程中其形態(tài)學的變化，以 RT-PCR 檢測 I、II 型膠原及軟骨特異性 Aggrecan 的 mRNA 表達，細胞免疫熒光化學染色的方法檢測細胞分化過程中I、II 型膠原的表達，堿性甲苯胺藍細胞化學染色檢測軟骨特異性 GAG 的表達，從轉錄和翻譯兩個水平尋找進入軟骨細胞分化譜系的證據，進而借此判斷聯合使用 TGF-b3、BMP-2 和 DEX 是否能夠誘導SMSCs 進入軟骨細胞分化譜系。

材料與方法

一、材料

向軟骨細胞方向誘導條件培養(yǎng)基：含 0.1 μmol / L DEX，10 ng / ml TGF-β3，500 ng / ml BMP-2 的DMEM HG 完全培養(yǎng)液；第一抗體：I 型膠原 ( 小鼠單克隆抗體 1∶100 )、II 型膠原 ( 小鼠單克隆抗體1∶100 )，第二抗體：羊抗小鼠 IgG-FITC 1∶100，羊抗小鼠 IgG-Cy3 1∶100，均購自 Sigma。RNA 抽提試劑盒購自上海生工生物技術有限公司；逆轉錄酶及相關試劑購自 Promega 公司；DNase I 及相關試劑購自 MBI 公司；PCR 相關試劑購自上海博光生物公司；瓊脂糖 ( BBI 公司生產 ) 購自上海增建生物科技有限公司；自配 TAE 電泳緩沖液 ( 50× )、溴化乙錠 ( ethidium bromide，EB ) 溶液 ( 10 mg / ml )、電泳加樣緩沖液 ( 6× )。

二、方法

1. 實驗動物和細胞來源：5 只成年新西蘭白兔平均 15 個月齡，體重 ( 2.2±0.65 ) kg，第二軍醫(yī)大學倫理委員會批準，膝關節(jié)活檢、無菌條件下取1 cm×1 cm 滑膜組織 ( synovial membrane，SM )，無菌 PBS ( phosphate-buffered saline solution，Gibco BRL Life Technologies，Carlsbad，CA，USA ) 沖洗后剪碎組織塊，放入 DMED ( Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco BRL ) 培養(yǎng)基內培養(yǎng)，加入 1% ( v / v ) 抗生素 ( 10 000 U / ml 青霉素，10 000 μg / ml鏈霉素，25 μg / ml 兩性霉素 B；Gibco BRL )。在DMEM ( Dulbecco modified Eagle medium；Gibco BRL )溶液中加入細菌膠原蛋白酶 II ( Gibco BRL ) 消化組織塊。37 ℃ 孵育過夜，40- μm 尼龍細胞濾器移除不溶物。150 g 4 ℃ 離心 7 min ( 離心半徑 13.5 cm，轉速 1500 r / min )，DMEM 沖洗兩遍后重懸收獲細胞。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)細胞后 72 h 獲得貼壁細胞，移除未貼壁細胞。37 ℃、5% CO2α-MEM 培養(yǎng)基中加入小牛血清，培養(yǎng)細胞每周換液 2 次，待細胞長滿培養(yǎng)皿后，胰蛋白酶消化傳代，獲得形態(tài)相似的貼壁細胞。

2. 干細胞鑒定：( 1 ) 流式細胞技術：使用流式細胞儀鑒定貼壁細胞的 CD44，CD105，CD90，CD13，CD14，CD106，CD17，CD34，CD73，CD81，SSEA-4 和 CD45 抗原。細胞經 75% 冰甲醇PBS 溶液 4 ℃ 冰浴 30 min，反復沖洗 3 次，胎牛血清 ( fetal bovine serum，FBS ) 封閉抗原，2×105細胞株使用鼠抗兔抗原標記前述 CD 抗原，單抗來源于BD Pharmingen ( San Diego，CA，USA )。陰性對照使用相同濃度的細胞，不進行抗原標記。使用 Becton Dickinson FACS Calibur 流式細胞儀和 CellQuest 軟件 ( Becton Dickinson ) 進行檢測和分析。( 2 ) 貼壁細胞的多向分化潛能鑒定：① 成軟骨分化：體外微團培養(yǎng)無血清 DMEM 培養(yǎng)基內加入 10 ng / ml 轉化生長因子 β3 ( transforming growth factor β3 TGF-β3 Biosource，Nivelles，Belgium )，移取 20 μl 2×107cells / ml SMSCs 懸液在 24 孔板內，貼壁 3 h。培養(yǎng)體系內加入 50 μg / ml 抗壞血酸，50 mg / ml ITS＋TMPremix ( 6.25 μg / ml 胰島素，6.25 μg / ml 轉鐵蛋白，6.25 ng / ml 亞硒酸，1.25 mg / ml 牛蛋白血清( bovine serum albumin，BSA )，5.35 mg / ml 亞麻酸( Sigma USA )，100 nM 地塞米松 ( Dexamethasone DEX Sigma USA )。每 2 天更換培養(yǎng)基維持 TGF-β3濃度為 10 ng / ml。培養(yǎng)后 2 周 PBS 沖洗，-20 ℃ 甲醇固定 30 min，pH0.2 條件下甲苯胺藍 ( 0.5% 甲苯胺藍 8 GS ( Carl Roth，Karlsruhe，Germany ) 加入 1 N HCl ) 染色過夜，蒸餾水反復沖洗后，200 μl 6 M 鹽酸胍室溫下萃取，分光光度法測定 630 nm 吸光值，定量分析。② 成骨分化：如前步驟 24 孔板內加入誘導成骨培養(yǎng)基，包含 10-7M DEX，0.2 mM 檸檬酸，10 mM β- 甘油磷酸鹽培養(yǎng) 21 天，3 周后根據蛋白質含量得到標準化的鈣含量，總鈣量使用“ μg / μg 蛋白”表達。二喹啉甲酸 ( bicinchoninic acid，BCA ) 法測定蛋白質含量，BSA 作為標準。③ 成脂分化：用成脂分化的培養(yǎng)基替代前述培養(yǎng)基，包括10-6M DEX、0.5 mM 3- 異丁基 -1- 甲基黃嘌呤、100 μM 吲哚美辛、10 μg / ml 胰島素。21 天后多聚甲醛固定 1 h，紅油 O 染色 2 h。

3. 體外誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞方向分化：向軟骨細胞誘導的培養(yǎng)基包括：45 ml DMEM HG、5 ml FBS、5 μl 1 mol / L DEX、50 μl 10 μg / ml TGF-β3、50 μl 0.5 mg / ml BMP-2、0.5 ml 100×P / S?；らg充質干細胞向軟骨細胞分化的誘導：將涂有多聚賴氨酸的蓋玻片置于 60 mm 的培養(yǎng)皿中，按50 cells / cm2接種第三代 SMSCs，當蓋玻片上的細胞生長至 20% 融合時，換向軟骨誘導的條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 14 天，每 3 天換 1 次液。

4. 分化過程的形態(tài)學觀察和分子表型的檢測：每天在倒置相差顯微鏡下觀察并通過顯微攝影記錄細胞形態(tài)和生長狀況。( 1 ) RT-PCR 檢測：收集加入誘導培養(yǎng)基后第 0 天，第 14 天的細胞，抽提總RNA，通過 RT-PCR 檢測細胞分化過程中 I、II 型膠原及細胞外基質 Aggrecan 的 mRNA 表達。同時以未誘導的第三代 SMSCs 作為對照。細胞總 RNA 的抽提：實驗前將與 RNA 接觸的玻璃器皿洗凈后置于 180 ℃ 烘烤 8 h，不耐高溫的耗材浸泡于 0.1% 的DEPC 溶液中 12 h，70 ℃ 烘烤干燥，然后于 121 ℃高壓滅菌 15 min，而后烘干。將貼壁培養(yǎng)的細胞消化成單細胞懸液，1500 r / min 離心后 5 min，完全棄去上清液，用“EZ Spin Column RNA Isolation Kit”試劑盒抽取細胞總 RNA。加入水溶解 RNA。保存于 -70 ℃。逆轉錄反應液配制：4 μl 細胞 RNA 樣品、反應液配平到 20 μl 后包含 0.5 μl dT-Adaptor引物 ( Gibco BRL )，濃度為 50 mM Tris-HCl ( pH 8.3 )，75 mM KCl，3 mM MgCl2，40 mM 二硫蘇糖醇 ( dithiothreitol DTT )，0.5 mM 脫氧核糖核酸混合液 ( deoxynucleotide triphosphate dNTP，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA )，10 unit RNase 抑制劑 ( Gibco BRL )，200 單位逆轉錄酶。37 ℃ 逆轉錄 60 min后，70 ℃ 作用 15 min 終止反應。使用 1 μl of E. coli RNase H ( 4 mg / ml ) 清除 RNA 模板，37 ℃ 反應30 min。使用前一步獲取的 cDNAs 作為模板進行PCR 擴增，使用特異的基因引物擴增目的基因和內參基因：3- 磷酸甘油醛 ( glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GAPDH ) 基因。引物表見表1。擴增反應在自動擴增儀 GeneAmp PCR System 2400 ( Applied Biosystems， Foster City，CA，USA ) 內完成25 μl 反應體系內包含 4 μl cDNA 溶液，4 μl of cDNA solution，20 mM Tris-HCl ( pH 8.4 )，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.1% Triton X-100，0.2 mM dNTP混合液，0.4 pM 引物以及 5 單位的 DNA 聚合酶( Promega，Madison，WI，USA )。反應條件：95 ℃5 min 后變性，進入循環(huán)：94 ℃ 30 sec → 55 ℃30 sec → 72 ℃ 1 min 循環(huán) 30 次，然后 72 ℃ 延長10 min，擴增產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察。( 2 ) 細胞免疫熒光化學染色：將長有細胞的蓋玻片在加入誘導培養(yǎng)基后第 0 天，第 14 天取出，進行細胞免疫熒光化學染色檢測細胞分化過程中 I、II 型膠原的表達。同時以未誘導的第三代SMSCs 作為對照。將涂有多聚賴氨酸的蓋玻片置于60 mm 的培養(yǎng)皿中，接種細胞；分別在加入誘導培養(yǎng)基后第 0 天，第 14 天取出長有細胞的蓋玻片，PBS 洗 3 次，用 4% 多聚甲醛 4 ℃ 固定 30 min；37 ℃ 干燥 2 h，將蓋玻片細胞面向上用中性樹膠粘在載玻片上。用 PBS 洗 3 次，每次 5 min。用含4% 山羊血清的 PBS 對細胞的非特異性結合位點封閉 15 min。加第一抗體，4 ℃ 孵育過夜。用 PBS 洗3 次，每次 5 min。加入二抗，分別為 FITC 標記-羊抗小鼠 IgG ( 1∶100 )，Cy3 標記-羊抗小鼠IgG ( 1∶150 )，室溫反應 1 h，PBS 洗 3 次，每次5 min。DAPI 染核，用熒光顯微鏡觀察。每次免疫熒光化學染色時，均設一張陰性對照片，不加一抗，其余過程相同。( 3 ) 堿性甲苯胺藍細胞化學染色：將長有細胞的蓋玻片在加入誘導培養(yǎng)基后第 14 天取出，進行堿性甲苯胺藍細胞化學染色檢測細胞分化過程中軟骨特異性的 GAG。同時以未誘導的第三代 SMSCs 作為對照。將長有細胞的蓋玻片在加入誘導培養(yǎng)基后第 14 天取出，PBS 洗 3 次，丙酮室溫固定 15 min，將蓋玻片細胞面向上用中性樹膠粘在載玻片上。PBS 浸洗 3 次，0.1% 堿性甲苯胺藍液浸染15 min。蒸餾水洗，洗去多余染液。冰醋酸分化至胞核和顆粒清晰，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

表1 RT-PCR 引物列表Tab.1 The list of RT-PCR primers

結 果

一、兔滑膜間充質干細胞 SMSCs 向軟骨細胞誘導分化過程中細胞形態(tài)學觀察

第三代兔滑膜間充質干細胞 SMSCs 在軟骨誘導培養(yǎng)基 ( 10 ng / ml TGF-β3，500 ng / ml BMP-2，0.1 μmol / L DEX ) 的誘導條件下，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，誘導后 14 天細胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切?，類似軟骨細胞樣形態(tài) (圖1B )。而未經誘導的 SMSCs形態(tài)基本保持梭形 (圖1A )。

二、RT-PCR 檢測誘導后 rSMSCs-2012-3 軟骨細胞相關分子的表達

SMSCs 在軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導后 14 天，RTPCR 可以檢測到 I、II 型膠原及軟骨特異性的聚集蛋白聚糖 ( aggrecan ) mRNA 表達，而未經誘導的rSMSCs-2012-3 不表達 I、II 型膠原及 aggrecan。以上進一步說明 rSMSCs-2012-3 在體外可向軟骨方向誘導分化 (圖2 )。

三、細胞鑒定

流式細胞儀得到 SMSCs 呈 CD90、CD13、CD14、CD106、CD81、CD73、CD44 陽性，CD45、CD14、CD34 陰性，未分化的間充質干細胞 CD151陰性，成軟骨誘導后的 CD151 陽性 (圖3 )。貼壁細胞具有成骨、成軟骨、成脂能力，符合多能干細胞標準 (圖4 )，可以證明獲得的貼壁細胞是來源于滑膜的多能間充質干細胞。

四、向軟骨細胞誘導后 SMSCs 表達 I、II 型膠原及糖胺聚糖

圖1 rSMSCs-2012-3 向軟骨誘導培養(yǎng) 14 天時形態(tài)學變化( ×200 ) A：未誘導的第三代 rSMSCs-2012-3 呈小梭形；B：第三代 rSMSCs-2012-3 誘導培養(yǎng)后 14 天呈多角形Fig.1 The morphological changes of rabbit SMSCs-2012-3 ( rSMSCs-2012-3 ) after 14 days’ induction in DMEM ( ×200 ) A: The 3rd generation of rSMSCs-2012-3 without the induction showed small spindle morphology; B: The 3rd generation of induced rSMSCs-2012-3 showed polygonal morphology

圖2 培養(yǎng) 14 天時 RT-PCR 檢測 I、II 型膠原及 Aggrecan 的mRNA ( 1 為誘導后的第三代 SMSCs 細胞；2 為未經誘導的第三代 SMSCs 細胞； Marker：Oso-M1200 100bp DNA Ladder 50T )Fig.2 Collagen I, collagen II and mRNA of AGN were detected by RT-PCR at the 14th day of induction. ( 1: The 3rd generation of induced SMSCs; 2: The 3rd generation of SMSCs without induction; Marker: Oso-M1200 100bp DNA Ladder 50T )

細胞免疫熒光化學染色分析 SMSCs 在軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導后 14 天表達 I、II 型膠原；未經誘導的 SMSCs 不表達 I、II 型膠原。說明 SMSCs 在軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導后 14 天進入軟骨細胞分化譜系，可作為種子細胞在同樣的誘導條件下向軟骨分化(圖5，6 )。

圖3 流式細胞儀得到 SMSCs 呈 CD90、CD13、CD14、CD106、CD81、CD73、CD44 陽性，CD45、CD14、 CD34 陰性，未分化的間充質干細胞 CD151 陰性，成軟骨誘導后的 CD151 陽性Fig.3 The fow cytometry showed CD90, CD13, CD14, CD106, CD81, CD73 and CD44 were positive, and CD45, CD14 and CD34 were negative. The undifferentiated mesenchymal stem cell CD151 was negative, and became positive after chondrogenic differentiation

圖4 三向分化實驗 ( 100× ) A：鈣結節(jié)染色鑒定成骨方向分化；B：甲苯胺藍染色鑒定成軟骨方向分化；C：紅油 O 染色鑒定成脂方向分化Fig.4 Three differentiation experiments ( 100× ) A: Identifcation of osteogenic differentiation with the calcium nodule staining; B: Identifcation of cartilage differentiation with the toluidine blue staining; C: Identifcation of adipogenic differentiation with the Oil Red O staining

堿性甲苯胺藍細胞化學染色結果顯示第三代SMSCs 在軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導后 14 天，細胞外基質中 GAG 分泌，說明誘導分化的細胞具備軟骨細胞特異的分泌特性。而未經誘導的 SMSCs 則不分泌GAG (圖7 )。

討 論

SMSCs 作為新的 MSCs 家族成員，顯示出與BMSCs 相似的多向分化潛能，在體外不同的誘導條件下 SMSCs 可以向不同的組織細胞分化。Sakaguchi等[5]發(fā)現 SMSCs 在添加 10-7M 地塞米松、0.5 mM異丁基 -1- 甲基黃嘌呤和 50 μM 吲哚美辛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 21 天，石蠟切片油紅 O 染色陽性，提示 SMSCs 有向脂肪細胞分化的潛能；SMSCs 在含有10-9M 地塞米松、20 mM β- 磷酸甘油脂、50 μg / ml維生素 C 二磷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 21 天，石蠟切片茜素紅染色陽性，提示 SMSCs 有向骨骼細胞分化的潛能。

圖5 細胞免疫熒光化學染色顯示 SMSCs 向軟骨誘導培養(yǎng) 14 天時 I 型膠原表達狀態(tài)。DAPI 染核 ( ×200 ) A：未誘導的 SMSCs不表達 I 型膠原；B：SMSCs 誘導培養(yǎng)后 14 天表達 I 型膠原Fig.5 The immunofluorescence staining showed the expression status of collagen I after SMSCs were induced to chondrocytes for 14 days. The 4’,6-diamidino-2-phenylindole ( DAPI ) nuclear staining ( ×200 ) A: SMSCs didn’t express collagen I without induction; B. SMSCs expressed collagen I after 14 days’ induction

圖6 細胞免疫熒光化學染色顯示 SMSCs 向軟骨誘導培養(yǎng) 14 天時 II 型膠原表達狀態(tài) ( DAPI 染核，×200 ) A：未誘導的 SMSCs不表達 II 型膠原；B：SMSCs 誘導培養(yǎng)后 14 天表達 II 型膠原Fig.6 The immunofluorescence staining showed the expression status of collagen II after SMSCs were induced to chondrocytes for 14 days ( DAPI nuclear staining, ×200 ) A: SMSCs didn’t express collagen II without induction; B: SMSCs expressed collagen II after 14 days’ induction

圖7 堿性甲苯胺藍細胞化學染色顯示 SMSCs 向軟骨誘導培養(yǎng)14 天時 GAG 分泌情況 ( ×200 ) A：未誘導的 SMSCs 細胞外基質中無 GAG 分泌；B：SMSCs 誘導培養(yǎng)后 14 天分泌 GAGFig.7 The alkaline toluidine blue staining showed the GAG status after SMSCs were induced to chondrocytes for 14 days ( ×200 ) A: SMSCs didn’t secrete GAG in the stroma without induction; B: SMSCs secreted GAG after 14 days’ induction

我們在實驗中發(fā)現，將 SMSCs 在添加 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 14 天，細胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切危霈F類似軟骨細胞樣的形態(tài)。RTPCR 檢測到 I、II 型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖( aggrecan ) mRNA 的表達，細胞免疫熒光化學染色也證實有 I、II 型膠原的表達，同時堿性甲苯胺藍細胞化學染色也證實有軟骨細胞特異性的胞外基質 GAG成分，這表明 SMSCs 已進入軟骨細胞分化譜系。

間充質干細胞在分化過程中要依賴于細胞-細胞和細胞-基質間的相互作用，通常是通過胞外信號分子誘導和調控的[6]。目前用于誘導 SMSCs 向軟骨細胞分化的培養(yǎng)基中常含有不同濃度的 DEX、TGF-βs 和 BMPs[1,5,7]。DEX 能促進細胞的有絲分裂，還能抑制 MSCs 向脂肪細胞分化，并可與 MSCs的糖皮質激素受體結合，激活細胞表面受體從而促進 MSCs 軟骨細胞分化[8-9]。TGF-βs 與其受體結合后激活磷酸化信號轉導途徑，信號通過 smad 和非smad 途徑傳導至胞核，進而激活轉錄因子 SOX-9，誘導軟骨生成相關基因的表達[10-11]。分子生物學技術證實該基因在軟骨生成中的有重要作用，將表達SOX-9 基因質粒轉染至細胞可以獲得軟骨表型，而敲除該基因則不能生成軟骨[12-13]。Nishimura 等[14]證實兔 SMSCs 在含有 DEX 的軟骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，TGF-β3 能夠誘導 SMSCs 合成軟骨細胞重要的標志物-II 型膠原。

另外，BMPs 在 SMSCs 向軟骨細胞分化過程中也發(fā)揮著重要的作用。Johnstone 等[15]首先報道單獨使用 TGF-β 在體外能促進 BMSCs 向軟骨細胞分化并形成軟骨。但是后來大量的研究表明單獨添加 TGF-β 并不能使得 MSCs 充分分化為軟骨細胞。Sekiya 等[16]在 TGF-β 基礎上額外添加 BMP-6 后使得軟骨細胞團重量增加了 10 倍，蛋白聚糖染色范圍也大大增加。Sekiya 等[17]又比較了 BMP-2、BMP-4、BMP-6 在體外促進 BMSCs 向軟骨細胞轉化時的影響，發(fā)現 BMP-2 效率最高。后來 Sakaguchi等[5]在評價細胞因子促進 SMSCs 向軟骨細胞轉化并形成軟骨的影響時，發(fā)現以聯合使用 BMP-2 和TGF-β3 最有效。Yokoyama 等[18]在體外誘導 SMSCs向軟骨細胞分化時，比較了在高糖 DMEM 培養(yǎng)基中不添加和聯合添加 BMP-2、TGF-β3 和 DEX 對軟骨細胞分化的影響，結果發(fā)現聯合添加上述細胞因子時可以顯著增加軟骨細胞團體積和軟骨基質的合成分泌。

因此本實驗中我們選擇添加 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 作為培養(yǎng)基，促使 SMSCs 向軟骨細胞譜系分化，以期獲得半月板組織工程的種子細胞。

與幾乎完全表達 II 型膠原的透明軟骨不同，正常半月板纖維軟骨組織中膠原成分中 I 型膠原占絕大多數，II 型膠原只占很小的一部分。我們在體外單層培養(yǎng)下培養(yǎng)后 14 天發(fā)現經誘導后的 SMSCs 既分泌 I 型膠原，也分泌 II 型膠原，所以我們只能說是經誘導后的 SMSCs 進入了軟骨細胞分化譜系。我們認為 SMSCs 形成最終的纖維軟骨細胞終期表現型表達是一個多因素決定的復雜過程，受到體內微環(huán)境、細胞因子、局部生物力學刺激和關節(jié)腔內低氧環(huán)境等多種因素的影響，而難以在體外培養(yǎng)條件下通過模擬體內環(huán)境的方法實現。因此，在后續(xù)實驗中，我們設計將已經誘導進入軟骨細胞分化譜系的SMSCs 借助小腸黏膜下層作為支架回植入體內，希望在體內環(huán)境中能完成纖維軟骨細胞的終期表現型表達。

在本實驗中，我們采用體外單層誘導培養(yǎng)的方法將 SMSCs 在添加 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后14 天，細胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切?，出現類似軟骨細胞樣的形態(tài)。RT-PCR 檢測到 I、II 型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖 ( aggrecan ) mRNA 的表達，細胞免疫熒光化學染色也證實有 I、II 型膠原的表達，同時堿性甲苯胺藍細胞化學染色也證實有軟骨細胞特異性的胞外基質 GAG 成分，這表明其已成功分化為軟骨細胞或者說已進入軟骨細胞分化譜系，可作為半月板組織工程的種子細胞。

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( 本文編輯：王永剛 )

Induction of rabbit synovial-derived mesenchymal stem cells into the chondrocyte lineage with the synergic stimulation of TGF-β3, BMP-2 and DEX in vitro

FU Pei-liang, CONG Rui-jun, ZHANG Lei, DING Zhe-ru, CHEN Song, LI Lin-tao, XU Zhen-yu, WU Hai-shan, WU Yu-li. Department of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital, the second Military Medical University, Shanghai, 200003, PRC

ObjectiveTo explore that synovial-derived mesenchymal stem cells ( SMSCs ) differentiated into the chondrocyte lineage induced by transforming growth factor-β3 ( TGF-β3 ), bone morphogenetic protein-2 ( BMP-2 ), and dexamethasone ( DEX ) in vitro culture conditions. After isolation and purification, SMSCs were induced to chondrocytes, which was certifed on the transcriptional and translational levels.MethodsSMSCs were obtained after isolation and purification by the adherence method, which were induced in high glucose Dulbecco modifed Eagle medium ( DMEM ) containing 500 ng/ml BMP-2, 10 ng/ml TGF-β3 and 10-7M DEX in vitro culture conditions. The morphologic changes during the differentiation process were observed using the inverted phase contrast microscope, and collagen I, collagen II and messenger-Ribonucleic Acid ( m-RNA ) expressions of cartilagespecific Aggrecan ( AGN ) were detected by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ( RT-PCR ). The immunofuorescence staining was used to detect the expressions of collagen I and II during the differentiation process, and the alkaline toluidine blue staining was used to detect the expressions of cartilage-specifc group-specifc antigen gene ( GAG ) to confrm the capability of SMSCs to differentiate into the chondrocyte lineage.ResultsAfter 14 days’induction, the small spindle SMSCs were gradually changed into the polygonal morphology, just like the chondrocytes.Collagen I, collagen II and expressions of AGN could be detected by RT-PCR. The results of immunofuorescence staining of collagen I and II and alkaline toluidine blue staining were positive. Without the induction, SMSCs basically maintained the spindle-shape morphology, and the gene expressions and staining results were negative. The differences between them were statistically signifcant. Based on the results of immunofuorescence staining, SMSCs expressed collagen I and II after 14 days’ induction in DMEM. Without the induction, SMSCs did not express collagen I or II. It was illustrated that SMSCs differentiated into the chondrocyte lineage after 14 days’ induction in DMEM, which could be used as the seed cells to differentiate into chondrocytes under the same condition.ConclusionsAs a new member in the family of mesenchymal stem cells ( MSCs ), SMSCs show the multi-differentiation potential which is similar to that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells ( BMSCs ). After induced in the high glucose DMEM containing 500 ng/ml BMP-2, 10 ng/ml TGF-β3 and 10-7M DEX, SMSCs enter into the chondrocyte lineage at the 14th day, which can be used as the seed cells for the meniscus tissue engineering.

Mesenchymal stem cells; Chondrocytes; Cell transdifferentiation; Transforming growth factors

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.02.013

Q23

國家自然科學基金青年科學基金項目 ( 81000798 )

200003上海市長征醫(yī)院骨科

吳宇黎，Email: wuyuli6019@189.cn

2013-01-30 )