李蘭蘭　陳玲肖　馬炬明

[摘要] 目的 建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）體外分離培養(yǎng)方法。方法 采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，進行形態(tài)學觀察，繪制生長曲線，流式細胞儀分析細胞周期、檢測細胞表面抗原標志物，并進行成脂、成骨分化誘導。 結(jié)果 獲取的BMSCs形態(tài)呈均一成纖維細胞樣，并呈集落樣生長。生長曲線呈S形，細胞周期顯示86.02% P3代細胞為G0/G1期，保持活躍的擴增能力。BMSCs 高表達CD44、CD90、低表達CD34、CD45。成脂誘導21 d后，可見細胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量紅染脂滴。成骨誘導21 d后，可見大量橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成。結(jié)論 全骨髓貼壁培養(yǎng)法可成功有效地分離培養(yǎng)BMSCs。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細胞；全骨髓貼壁法；鑒定

[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）01-0007-04

BMSCs具有高度增殖的能力、體外基因轉(zhuǎn)移效率高以及多向分化潛能等優(yōu)點[1-2]，使其成為組織工程、細胞替代治療等領(lǐng)域的首選種子細胞。但是骨髓中的間充質(zhì)干細胞含量極低[3]，且其含量隨年齡增長而逐漸減少[4]，需經(jīng)體外分離、純化、擴增為純度高、活力強、生物特性均一的間充質(zhì)干細胞才能滿足組織工程需求。實驗旨在建立一套簡便有效的BMSCs原代培養(yǎng)方法，為后續(xù)實驗做好準備。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠6只，4周齡，體質(zhì)量100 g，由浙江省實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。

1.2 時間及地點

于2013年1～6月在中國人民解放軍第一一七醫(yī)院干細胞治療中心完成。

1.3 實驗主要試劑

低糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/鏈霉素（吉諾生物），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），細胞周期即時檢測試劑盒（凱基生物），成骨及成脂誘導分化培養(yǎng)液、茜素紅、油紅O（Cyagen公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 BMSCs的原代分離培養(yǎng) 用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，置于75%的乙醇中浸泡7 min。無菌條件下分離股骨和脛骨，眼科剪切除兩端骨骺，用2.5 mL注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，待骨髓腔變白。充分吹打混勻，經(jīng)200目不銹鋼標準篩過濾掉大的團塊。收集細胞懸液于15 mL離心管中，400 g室溫離心5 min。離心后去上清，用5 mL完全培養(yǎng)液重懸，混勻，轉(zhuǎn)移至25 cm培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后首次全量換液，以后每3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與生長情況。

1.4.2 BMSCs的純化擴增 待細胞融合至80%開始傳代，PBS沖洗。加入1.0 mL預熱的0.25%胰酶-0.02%EDTA，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，室溫孵育0.5 min，待鏡下胞質(zhì)回縮后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，并輕輕吹打培養(yǎng)瓶底。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，400 g室溫離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)液重懸，以1∶2或1∶3比例進行傳代培養(yǎng)。此時細胞記為P1，以后每周換液2次，待細胞融合達80%后，重復上述步驟進行傳代，依次記為P2、P3等。

1.4.3 BMSCs 的生長曲線測定 取生長良好的第3代細胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA常規(guī)消化，以2×104/mL 接種于24孔板，每天取3孔消化計數(shù)，每孔計數(shù)3次，計算均值，連續(xù)8 d。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸，描繪生長曲線。

1.4.4 流式細胞儀檢測細胞周期 取生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs，常規(guī)消化，制成單細胞懸液，將200 μL 4℃預冷的乙醇與細胞懸液均勻固定，室溫孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，盡量避免產(chǎn)生氣泡，室溫孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室溫避光孵育15 min，上機檢測。

1.4.5 流式細胞儀檢測細胞表面標記 待第3代BMSCs融合至80%，常規(guī)消化制成單細胞懸液，分裝至EP管中。于待檢測的樣本中各加入100 μL PBS重懸，分別加入CD34，CD44，CD45，CD90一抗及同型對照10 μL，充分混勻，室溫避光孵育30 min后，用PBS洗滌2次，400 g，室溫離心5 min，棄上清，每測試管加500 μL PBS，充分混勻，流式細胞儀檢測。

1.4.6 成脂肪細胞誘導分化 待培養(yǎng)的P3 BMSCs生長至80%融合，常規(guī)消化，以2×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板，每3天換新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，待細胞完全融合后，實驗組加入2 mL成脂肪誘導分化培養(yǎng)液A，3 d后將分化誘導液換為成脂肪誘導分化培養(yǎng)液B，1 d后再換回成脂肪誘導分化培養(yǎng)液A進行誘導，如此循環(huán)3～5次后，用成脂肪誘導分化培養(yǎng)液B繼續(xù)維持7 d，每3天進行換液，對照組加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與生長情況，21 d后進行油紅O染色。

1.4.7 成骨細胞誘導分化 待培養(yǎng)的P3 BMSCs生長至80%融合，常規(guī)消化，以3×104/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板（培養(yǎng)皿底部有明膠包被），常規(guī)培養(yǎng)1 d后，細胞達50%～70%融合，實驗組加入2 mL成骨誘導分化培養(yǎng)液，對照組加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每3天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與生長情況。成骨誘導21 d后進行茜素紅染色。endprint

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學觀察

剛接種時細胞懸浮于培養(yǎng)液中，呈圓形，大小不一，折光性較強。48 h首次換液后可見大量細胞貼壁，形態(tài)不一，部分伸出偽足。三四天貼壁細胞數(shù)量增多，細胞偽足增長呈短梭形。五六天細胞增殖迅速呈克隆樣生長的集落。八九天左右細胞形態(tài)基本為長梭型細胞，縱軸相互平行排列，一般可達到80%的細胞融合狀態(tài)。傳代細胞接種4 h后基本完全貼壁，很快鋪展。細胞增殖速度較原代快，呈均勻分布的紡錘形，五六天即可傳代，見圖1。

圖1 P3 BMSCs培養(yǎng)5 d，×100

2.2 BMSCs的生長曲線

接種后，BMSCs經(jīng)過1～2 d的潛伏適應(yīng)期后進入對數(shù)增殖期，第7天達頂點，隨后進入平臺期（平均細胞計數(shù)依次為2、2.22、2.44、3.33、5.67、7、8.22、8.11×104/孔），生長曲線呈S形，符合正常細胞的生長特性，見圖2。

2.3 細胞生長周期

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，第3代BMSCs中G0/G1期細胞為86.02%，G2期細胞為5.41%，S期細胞為4.90%，見圖3。

圖3 P3 BMSCs細胞周期

2.4 BMSCs表面標記物的表達

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，細胞CD44、CD90陽性率分別為96.2%、97.9%，CD34、CD45陽性率分別為0.3%、0.9%，驗證此細胞為BMSCs，純度較高，見圖4。

2.5 誘導分化鑒定

成脂誘導后細胞逐漸由梭形變?yōu)閳A形，油紅O染色可見橙紅色折光性強的脂滴，呈圓形，定位于胞漿，見圖5A。成骨誘導后細胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，局部細胞呈重疊生長，染色后可見大量橘紅色致密結(jié)節(jié)形成，見圖5B。對照組均呈陰性染色。

A：實驗組油紅O染色；B：實驗組茜素紅染色

圖5 多向分化功能鑒定（×100）

3 討論

BMSCs是一種存在于骨髓間質(zhì)內(nèi)的非造血系成體干細胞，可以自體取材，具有多向分化潛能，無倫理學限制。目前分離方法主要包括密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細胞儀分離法及免疫磁珠分離法[5]。后兩種方法分離的細胞純度較高，但價格昂貴，對細胞活性有較大影響，目前應(yīng)用較少。楊麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，全骨髓貼壁法比密度梯度離心法更加簡單實用，降低了離心對細胞的損害，分離的細胞貼壁時間短，增殖快?？紤]離心過程中，丟失了促進BMSCs貼壁的一些生長因子及促黏附物質(zhì)，改變了骨髓中原有的微環(huán)境，所用的分離液對細胞有一定的毒性作用，影響細胞的活性。林楚偉[7]等證實全骨髓貼壁加差速傳代法分離培養(yǎng)的BMSCs生長增殖活力強于密度梯度離心法。張君紅[8]等觀察到使用SD雌性大鼠分離后的細胞懸液含有較多脂滴，貼壁細胞不牢固且傳代困難，可能與雌、雄性大鼠體內(nèi)的雌、雄激素等水平存在差異有關(guān)。

全骨髓貼壁法是利用BMSCs對塑料底的貼附性，定期換液去除懸浮生長的造血系細胞，進行分選純化。利用BMSCs較巨噬細胞、單核細胞等易于消化的特點，嚴格掌握消化酶的量及消化時間，發(fā)現(xiàn)細胞間隙增大后，應(yīng)立即消化，輕柔吹打，盡量避免出現(xiàn)氣泡。注意傳代時的細胞融合程度，避免細胞接觸抑制，延緩細胞老化的時間。BMSCs生長時密度依賴性極強[9]，注意傳代細胞的種植密度。首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，使細胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境。

多數(shù)學者認為采用形態(tài)學觀察、增殖能力、表面標志及多向分化的特點進行逆向推斷是否為BMSCs[10]。大量的研究表明BMSCs表達CD29、CD44、CD71、CD73、CD90和CD105等表面標志，不表達造血細胞的表面標志如CD14、CD34、CD45、CD106等[11]。本方法所培養(yǎng)細胞為貼壁生長細胞，呈長梭形、紡錘形等成纖維細胞形態(tài)，大小比較均一，呈“漩渦狀”生長。細胞生長曲線呈S形，經(jīng)歷潛伏適應(yīng)期、對數(shù)增殖期、平臺期，符合正常細胞的生長特性。流式細胞儀檢測結(jié)果提示大多數(shù)BMSCs處于靜止期，保持自我更新和增殖潛能，約10%處于功能期，具有強大的分化增殖能力。高表達細胞表面抗原CD44、CD90，低表達CD34、CD45，能向成骨、成脂分化，具有多向分化潛能，符合國際細胞治療學會間充質(zhì)及組織干細胞委員會提出的鑒定動物來源BMSCs的三條最低標準，為下一步探討B(tài)MSCs逆轉(zhuǎn)肝纖維化的機制提供功能穩(wěn)定的種子細胞。

盡管對間充質(zhì)干細胞的研究已很深入，但其缺乏特異性表型標志物，如何準確簡便地鑒定BMSCs以及其體外分化誘導機制尚不清楚，還有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Chamberlain G，F(xiàn)ox J，Ashton B，et al. Concise Review：Mesenchymal stem cells their phenotype，differentiation capacity immunological features and potential for homing[J].Stem Cells，2007，25（11）：2739-2749.

[2] Lysy PA，Campard D，Smets F，et al. Persistence of a chimerical phenotype after hepatocyte differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Cell Prolif，2008， 41（1）：36-58.

[3] Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science，1999，284（5411）：143-147.endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 楊麗，張榮華，謝厚杰，等. 建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚偉，周勝華，杜優(yōu)優(yōu). 全骨髓貼壁并差速傳代分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞：與密度梯度離心法的比較[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 張君紅，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓細胞貼壁法分離與培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化能力[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 楊麗，張榮華，謝厚杰，等. 建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚偉，周勝華，杜優(yōu)優(yōu). 全骨髓貼壁并差速傳代分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞：與密度梯度離心法的比較[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 張君紅，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓細胞貼壁法分離與培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化能力[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

（收稿日期：2013-08-23）endprint

[4] Ohgushi H，Caplan AI. Stem cell echnology and bioceramices：from cell to gene engineering[J]. J Biomed Mater Res，1999，48（6）：913-927.

[5] Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al. Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics[J]. Exp Hematol，2008，36（9）：1176-1185.

[6] 楊麗，張榮華，謝厚杰，等. 建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（6）：1064-1068.

[7] 林楚偉，周勝華，杜優(yōu)優(yōu). 全骨髓貼壁并差速傳代分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞：與密度梯度離心法的比較[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（14）：2508-2512.

[8] 張君紅，姜海行，覃山羽，等. 全骨髓細胞貼壁法分離與培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化能力[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2012，16（36）：6685-6689.

[9] Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells[J]. Gene Ther，2002，9（11）：754-758.

[10] Shu XC，Zhu DH，Liu JJ，et al. In vitro studies on the growth and proliferation characteristics of rat bone mesenchymal stem cells[J]. Zhonghua Yufang Yixue Zazhi，2010，44（10）：923-927.

[11] De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett，2003，89（2-3）：267-270.

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