陳以勝 李曉紅 張 賽

綜述

基于生物力學的干細胞調(diào)控及相關物理性質(zhì)的測定

陳以勝 李曉紅 張 賽△

干細胞移植對許多疾病有治療作用，但移植部位微環(huán)境的改變會影響干細胞的生長、遷移及分化等一系列進程。目前對化學微環(huán)境如缺氧、神經(jīng)生長因子、某些離子等的研究較為深入，并形成了相應的針對臨床的治療措施，但對移植相關的物理微環(huán)境知之甚少，對損傷相關的機械力、基質(zhì)彈性和硬度等力學因素的調(diào)控及檢測有待進一步研究。本文就力學微環(huán)境對干細胞的影響以及相關物理指標的測定方法進行綜述。

干細胞；細胞外基質(zhì)；力學信號轉(zhuǎn)導；原子力顯微鏡

干細胞巢指干細胞所處的局部微環(huán)境構成，一般包括干細胞的相鄰細胞、黏附分子及基質(zhì)等，可以將它定義為一種結構與功能的綜合體，維持著局部組織的穩(wěn)態(tài)、促進損傷后組織的修復與再生[1]。干細胞巢通過不同信號途徑調(diào)控著干細胞的行為，維持著細胞之間信息交換、細胞與基質(zhì)的黏附以及各種生物化學信號傳遞等一系列過程，使干細胞的自我更新和分化處于平衡狀態(tài)[2]。即使沒有生物化學因素的參與，基質(zhì)的硬度、細胞表面的形貌以及細胞所受的外力等力學因素也能調(diào)控干細胞的生長、遷移及分化[3]。

1 細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）與干細胞力學微環(huán)境的關系

ECM是組織的重要成分，主要由膠原、糖蛋白、蛋白聚糖等構成，為一種含水膠狀物，它由細胞本身所分泌，為細胞生長、黏附、增殖、分化、形態(tài)及基因表達提供力學支撐[4]。ECM對細胞功能及分化方式具有調(diào)節(jié)作用，并為體外培養(yǎng)的干細胞提供微環(huán)境，因此在組織工程學上可以此為基礎制作二維或三維培養(yǎng)基對干細胞進行培養(yǎng)[5]。

ECM對干細胞的力學微環(huán)境具有調(diào)節(jié)作用，而力學微環(huán)境的改變也會反過來影響ECM。Mauch等[6]率先研究力學微環(huán)境對ECM成分表達的影響，他們將細胞分別置于堅硬的二維培養(yǎng)基質(zhì)和彈性相對較大的三維膠原凝膠中培養(yǎng)，并比較ECM的組成成分及相關調(diào)節(jié)酶的表達，研究發(fā)現(xiàn)，彈性較大的三維培養(yǎng)基比硬度較大的二維培養(yǎng)基中成纖維細胞的膠原表達量明顯降低；在三維膠原支架中培養(yǎng)的細胞，其表達α1（Ⅰ）、α2（Ⅰ）和α1（Ⅲ）型膠原蛋白的mRNA水平均降低；而在硬度較小的三維膠原支架中培養(yǎng)的細胞，其膠原蛋白酶活性大大增強。基質(zhì)的硬度不僅影響ECM成分，還會影響與這些成分沉淀及相互結合有關的其他參數(shù)[7]。由此可見，細胞所處的力學微環(huán)境可調(diào)節(jié)細胞本身對ECM成分的分泌，而ECM成分的改變反過來影響細胞所處微環(huán)境的力學性質(zhì)，比如硬度或彈性。正常生理情況下，人體細胞與其所處的在體環(huán)境之間保持著一種力學穩(wěn)態(tài)，因此細胞可維持正常的性質(zhì)和功能。同樣，干細胞的存活、增殖和分化也需要特定的生長環(huán)境，在一定程度上可以對這種力學環(huán)境進行干預，以促進干細胞的增殖并引導其向不同方向分化[8]。

人間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的形態(tài)及分化方式對生存環(huán)境極其敏感。首先，基質(zhì)的硬度能控制MSCs的命運，Engler等[9]通過模擬在不同硬度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)離體MSCs，觀察各種條件下細胞的分化，發(fā)現(xiàn)MSCs培養(yǎng)基彈性越接近大腦組織的彈性（0.1～1 kPa），多數(shù)能向神經(jīng)細胞分化，隨著基質(zhì)硬度的增加，則更多向脂肪組織或骨組織進行分化，該研究指出，雖然基質(zhì)彈性不是干細胞分化的最終決定因素，但對其過渡到早期的發(fā)展譜系具有一定引導作用。其次，細胞形態(tài)會影響干細胞。McBeath等[10]通過應用微縮成像技術調(diào)控細胞的形狀和細胞變形（攤開）的程度，然后在二維環(huán)境下進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs在接觸變形（攤開）的情況下大多分化為骨細胞，而在無形態(tài)變化的圓形情況下多數(shù)分化為脂肪細胞，其又發(fā)現(xiàn)RhoA是在自然條件下調(diào)控細胞形狀的因子，進而證實了細胞形態(tài)、細胞骨架及RhoA信號共同調(diào)節(jié)MSCs的分化。而之后有研究在三維培養(yǎng)條件下進行了類似的研究，得出與此相悖的結論[11]。有研究發(fā)現(xiàn)應用電子束曝光技術描述細胞表面形貌圖時，相關形貌圖的改變也會影響干細胞的分化[12]。此外，某些機械力也通過調(diào)節(jié)干細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）或鈣調(diào)蛋白等基因的表達，進而影響干細胞的分化命運[13]。

2 模擬干細胞在體生長環(huán)境

對干細胞的培養(yǎng)及研究通常是在一種模擬人體組織環(huán)境的二維培養(yǎng)基或三維培養(yǎng)基進行。前者在過去應用比較多，比如在不同彈性模量的聚丙烯酰胺水凝膠上培養(yǎng)細胞，以明確其生長及分化情況。Robert等[14]較早對這一培養(yǎng)方法進行試驗，并通過宏觀力學方法測定水凝膠的彈性模量。隨后Engler等[15]不斷改進這一方法，并從宏觀的彈性拉伸儀和微觀的原子力顯微鏡兩個角度對彈性模量進行描述，較之前更為精確。由于通過單丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的不同濃度配比可以合成不同彈性模量的聚丙烯酰胺水凝膠，因此這一材料在研究生物力學對干細胞的影響方面應用比較普遍。

二維培養(yǎng)環(huán)境中生長的細胞因受到單純牽張力或壓縮力的影響，不能模擬真實的人體組織環(huán)境，因此在研究機械力學對細胞的影響及相關的力學信號轉(zhuǎn)導機制方面受到一定限制。目前有許多研究應用三維支架針對干細胞進行培養(yǎng)，并通過調(diào)節(jié)力學載荷和基質(zhì)硬度來觀察細胞的生長情況，已經(jīng)取得較好的效果，證明了三維支架在體外培養(yǎng)細胞方面的優(yōu)勢[11]。三維培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)基的力學性質(zhì)可隨細胞的生長變化而改變，同時細胞也能感受ECM的硬度變化并作出相應的反應，如生長狀態(tài)、形態(tài)、遷移和分化等均可能發(fā)生改變。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著三維微環(huán)境硬度的變化，MSCs的分化方式也發(fā)生相應改變，比如在彈性模量為11～30 kPa的培養(yǎng)基中，MSCs大部分向成骨細胞分化，在彈性模量為2.5～5.0 kPa的培養(yǎng)基中則多向脂肪細胞分化，而在更軟的培養(yǎng)條件下，可能向神經(jīng)元進行分化。相比之前的應用二維培養(yǎng)基質(zhì)所進行的細胞研究，細胞的命運與其形態(tài)并不相關，基質(zhì)的硬度通過調(diào)節(jié)整合素的結合以及黏附配體的重新組合而發(fā)生變化[16]。然而，ECM在三維微環(huán)境下具體對干細胞起到怎樣的作用及其潛在的生物物理機制仍需要進一步探討。

聚乙烯醇、明膠、殼聚糖等都曾用于干細胞的三維培養(yǎng)，殼聚糖及其衍生物制備的海綿支架對細胞遷移和神經(jīng)軸突再生有重要作用，其相容性好，物理性狀接近腦組織，力學特性和損傷組織相似，具有一定的黏彈性和抗壓性能[17]，易使細胞在其表面附著生長，因此在神經(jīng)組織工程領域具有較廣闊的應用前景[18]，在研究顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）后干細胞腦內(nèi)原位移植方面也具有重要意義。

3 干細胞力學信號轉(zhuǎn)導機制

細胞與ECM之間的相互作用是真核細胞生物學的核心[19]，因此，操控著細胞生長命運的實質(zhì)上是以物質(zhì)體系為基礎的細胞與胞外物質(zhì)的相互作用，尤其是自然條件下ECM中包含的整合素結合配體[20]。不論細胞受到何種機械力（如牽張力、剪切力或壓縮力等）作用，其力學信號轉(zhuǎn)導的分子機制類似，三維基質(zhì)中力學感受蛋白及黏附結構的轉(zhuǎn)變是完成信號轉(zhuǎn)導過程的基礎[21]。細胞表面的整合素和ECM中的一系列相關蛋白是細胞黏附復合物的重要組成成分，整合素是由1條a鏈和1條b鏈組成的二聚體，充當ECM中某些成分的受體，這兩條鏈的結合方式有20余種，不同的結合物作為特定ECM配體的受體參與力學信號轉(zhuǎn)導途徑中。以整合素為基礎的黏附復合物是一種復雜的動態(tài)結構，它是信息從ECM傳遞到細胞所必需的[22]。當整合素與配體結合后，一方面導致細胞骨架重排、微絲蛋白構象改變，最終與染色體接觸引起細胞功能改變；另一方面激活FAK，F(xiàn)AK磷酸化后激活其下游信號轉(zhuǎn)導途徑，如Ras∕MAPK途徑，繼而活化轉(zhuǎn)錄因子和AP-1家族，導致細胞增殖的改變[23]。由于整合素缺乏酶的活性，它只能在ECM和細胞骨架上的肌動蛋白或其他信號蛋白之間起物理連接作用，如此便形成ECM-整合素-細胞骨架這個連接模式[24]，除了上述基本結構，還有許多信號分子也參與到力學信號轉(zhuǎn)導途徑中，比如FAK、JNK、Ca2+和最近研究發(fā)現(xiàn)的YAP和TAZ等[23]。激活細胞膜力敏感離子通道使細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，可導致細胞明顯增殖，由于Ca2+是力信號轉(zhuǎn)導途徑中重要的第二信使，研究人員由此認為Ca2+動員增強是導致細胞增殖增強的一個重要因素[25]。觸動G蛋白偶聯(lián)的酪氨酸激酶磷酸化與MAPKs調(diào)節(jié)的級聯(lián)反應也被認為是機械載荷刺激干細胞后的一個信號的轉(zhuǎn)導通路[26]。當然，雖然存在著多條不同的信號轉(zhuǎn)導通路，但它們之間是密切聯(lián)系的，這表明在感受應力刺激的過程中需要的是整個細胞的參與，而不可能只依賴于單一的信號轉(zhuǎn)導通路。

4 對細胞表面形貌、微觀力學及組織彈性的測定

原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）可實時測量生理狀態(tài)生物樣品分子間作用力的動態(tài)變化，如化學基團間的作用力、受配體作用、DNA互補鏈和核苷堿基間的氫鍵、運動蛋白質(zhì)間的相互作用等，進而綜合研究生理環(huán)境中的各種生物樣品的微觀性質(zhì)[27]。它具有高分辨率，對振幅及方向的精確控制，對細胞和組織損傷小，能描述細胞表面的形態(tài)并與細胞發(fā)生相互作用等特點，是唯一能讓研究人員獲得高清的細胞表面形貌數(shù)據(jù)、控制細胞所受的作用力、測量細胞彈性并調(diào)控存活細胞彈性模量的工具，主要分接觸式與敲擊式兩種模式[28]，后者在細胞研究中更常用。

當原子力顯微鏡懸臂梁上的針尖靠近細胞或基質(zhì)表面進行水平掃描成像時，針尖隨著表面的起伏而改變高度，從而得到細胞或培養(yǎng)基質(zhì)的表面形貌圖像[29]，在研究細胞形態(tài)學上具有很大優(yōu)勢。如果將針尖相對樣品在豎直方向來回運動，在力譜測量過程中系統(tǒng)通過一系列轉(zhuǎn)化可繪得力-距離曲線[30]，既可以得到牽引力、表面張力等微觀力學指標，又可間接得到彈性模量值。它已被廣泛用于測量存活神經(jīng)元以及腦組織切片的彈性模量，根據(jù)不同測量目的，選擇不同AFM的針尖。若要測得組織團塊的彈性模量，一般選用圓頭的針尖；若要測量細胞表面定點作用力或細胞的彈性模量，則應選擇錐型針尖[31]。

除了原子力顯微鏡外，彈力試驗機也可測量物體的彈性模量，但該儀器主要是從宏觀角度針對形狀規(guī)則的材料進行測量，通過對材料進行拉伸或壓縮，根據(jù)施加的力及相應的材料應變程度，電腦繪制出相應曲線圖，進一步獲得彈性模量值，材料的厚度也可同時得出[32]。

5 展望

細胞生物力學目前倍受關注，在各種內(nèi)外機械因素影響下，尤其是在外傷性疾病中信息通過力學信號轉(zhuǎn)導作用于人體細胞，導致細胞發(fā)生一系列的病理生理變化，最終影響細胞的生長、增殖、分化。顱腦創(chuàng)傷不僅會引起神經(jīng)細胞損害和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，而且通常伴隨腦水腫、顱內(nèi)高壓及腦組織彈性變化，治療比較棘手。亞低溫聯(lián)合溫敏干細胞移植對促進TBI后神經(jīng)功能恢復作用在之前研究中已得到證實[33]，這種聯(lián)合治療方式不僅能保證較高的移植干細胞存活率，而且增加了干細胞的增殖和向神經(jīng)元分化的能力。由于亞低溫可降低腦組織代謝率，在一定程度上可能改善顱腦創(chuàng)傷后缺氧所致的腦水腫，筆者據(jù)此推斷亞低溫通過改善腦組織的力學微環(huán)境，進一步調(diào)節(jié)移植干細胞的增殖、凋亡和分化情況，這可能是干細胞移植的一種力學機制。在之前的研究基礎上，可以通過測定相關物理指標對該力學微環(huán)境進行評估，殼聚糖及凝膠等生物材料的研發(fā)，也為體外模擬細胞在體環(huán)境提供技術支撐，為下一步干細胞的三維培養(yǎng)和力學信號轉(zhuǎn)導途徑及其相應治療措施的研究奠定基礎。

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（2014-04-23收稿 2014-05-15修回）

（本文編輯 閆娟）

Regulation of Stem Cells Based on the Biomechanics and Measurement of their Associated Physical Properties

CHEN Yisheng,LI Xiaohong,ZHANG Sai△
Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience of CAPF，The Affiliated Hospital of The Logistics University of CAPF，Tianjin 300162,China.
△

E-mail:zhangsai718@yahoo.com

Stem cells transplantation had been proved to be effective in many clinical diseases.However,microenvironment can influence their growth,migration and differentiation.Under chemical microenvironment,such as hypoxia,neural growing factors and different kinds of ions,stem cells had been intensively studied while little is known about their performance under physical microenvironment.The effects of mechanical forces,elasticity and rigidity of the matrix of stem cells are still to be further investigated.This article is to summarize how microenvironment controls the fate of stem cells and to review the measurement of the mechanical properties.

stem cells;extracellular matrix;mechanotransduction;atomic force microscope

R318

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.023

國家自然科學基金項目（81271392，81301050）

武警部隊腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，武警后勤學院附屬醫(yī)院（郵編300162）

△通訊作者 E-mail：zhangsai718@yahoo.com