卜令軍，李 玉，路福平，王正祥

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

利用木糖母液生產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵工藝的初步研究

卜令軍，李 玉，路福平，王正祥

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

研究了以木糖工業(yè)化生產(chǎn)的副產(chǎn)物木糖母液為碳源，利用地衣芽孢桿菌工程菌(Bacillus licheniformis)TCCC11843發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶的工藝．對(duì)搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了接種種齡為12,h，接種量為8%，培養(yǎng)基初始pH為6.5，發(fā)酵溫度為34,℃，在24,h一次補(bǔ)加4.0,mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%木糖母液，此時(shí)的發(fā)酵液酶活力峰值為7,838,U/mL；在此基礎(chǔ)上，又在7,L發(fā)酵罐上實(shí)現(xiàn)了木糖母液的反饋補(bǔ)料，酶活力在80,h時(shí)達(dá)峰值，為14,912,U/mL．該結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)堿性蛋白酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化提供了新的思路．

木糖母液；地衣芽孢桿菌；堿性蛋白酶；補(bǔ)料發(fā)酵

堿性蛋白酶是指水解蛋白質(zhì)肽鍵的最適作用pH在堿性范圍的一類蛋白酶類，其最適作用pH一般為9～11[1–3]，在洗滌劑生產(chǎn)、食品加工、醫(yī)藥、皮革制造、絲綢制造、環(huán)境保護(hù)等行業(yè)[4–9]都有應(yīng)用．目前，堿性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)主要利用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)2709、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CW301、枯草芽孢桿菌CW302等菌株，以玉米粉、葡萄糖、蔗糖等作為碳源，這些碳源的利用勢(shì)必消耗大量糧食資源，增加堿性蛋白酶的生產(chǎn)成本，因此，開發(fā)營(yíng)養(yǎng)全面、價(jià)格低廉的優(yōu)質(zhì)碳源具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益．

木糖母液是在木糖工業(yè)化生產(chǎn)中的副產(chǎn)物．在目前的木糖生產(chǎn)中，由于半纖維素水解液中尚存在葡萄糖等雜糖，濃縮糖液的黏度較大，影響了木糖的結(jié)晶得率；在分離出晶體木糖后的母液中，雜糖含量較高，即使再經(jīng)過濃縮，也很難再使木糖結(jié)晶析出，從而產(chǎn)生大量的木糖母液[10–12]．木糖母液的主要成分為木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖等，價(jià)格大約只有2,000元/噸．如果能將木糖母液中的糖分充分利用起來，將帶來巨大的環(huán)境效益與經(jīng)濟(jì)效益[13]．為降低生

產(chǎn)成本，汪東升等[14]對(duì)肺炎克雷伯氏菌利用木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)2，3–丁二醇進(jìn)行研究，并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得到2，3–丁二醇質(zhì)量濃度為35.7,g/L，比優(yōu)化前提高了7.5,g/L，得率達(dá)到了理論得率的92%；周立國(guó)等[15]利用木糖母液生產(chǎn)的醬色素易溶于水、著色率高、紅色素達(dá)到5.5以上，對(duì)溫度、光照、pH耐受性強(qiáng)、穩(wěn)定，十分適合調(diào)味品工業(yè)．木糖母液具有巨大的應(yīng)用潛能，因此，本文選擇木糖母液為碳源，利用前期已構(gòu)建成功的地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843生產(chǎn)堿性蛋白酶，并優(yōu)化其發(fā)酵工藝，提高堿性蛋白酶酶活，以期為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)工程菌TCCC11843，保藏于天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院酶與應(yīng)用微生物研究室．

1.1.2 試劑

卡那霉素和L–酪氨酸，Sigma公司；干酪素，上海申翔化學(xué)試劑有限公司；福林試劑，北京索來寶科技有限公司；木糖母液，福田藥業(yè)；豆粕粉，市售；脫脂奶粉，完達(dá)山乳業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基

脫脂奶粉平板培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，脫脂奶粉10，瓊脂20，卡那霉素30,μg/mL，pH 7.0．

種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉粉1.50，酵母粉1.50，蛋白胨5.00，磷酸二氫鉀1.32，磷酸氫二鉀3.68，葡萄糖1.00，氯化鈉3.00，卡那霉素30,μg/mL，pH 7.0～7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：木糖母液40，豆粕粉45，硫酸銨5，氯化鈣0.2，氯化鈉0.63，磷酸氫二鈉1.0，磷酸二氫鈉0.65．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)，在250,mL三角瓶(40,mL裝液量)中分別考察種齡、初始pH、接種量和發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響．種齡分別選取8、10、12、14、16,h；發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別選取5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；接種量分別選取2%、4%、6%、8%、10%；發(fā)酵溫度分別選取25、28、30、34、37、40,℃．

1.2.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

利用發(fā)酵培養(yǎng)基、優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，在三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每隔8,h取樣，測(cè)其酶活力和殘?zhí)琴|(zhì)量濃度．

1.2.3 補(bǔ)料量的確定

根據(jù)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶情況，在24,h分別向三角瓶中補(bǔ)加2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的木糖母液補(bǔ)料液，考察補(bǔ)料量對(duì)產(chǎn)酶的影響．

1.2.4 反饋補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在7,L發(fā)酵罐(4,L裝液量)發(fā)酵過程中流加氨水，維持發(fā)酵液的pH為6.5．測(cè)定發(fā)酵液酶活力與殘?zhí)琴|(zhì)量濃度，根據(jù)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度調(diào)整蠕動(dòng)泵，改變補(bǔ)料速率，在發(fā)酵過程中維持殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為13,g/L左右．當(dāng)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度小于11,g/L時(shí)，調(diào)大蠕動(dòng)泵的流量以加大補(bǔ)料速率；當(dāng)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度大于15,g/L時(shí)，調(diào)小蠕動(dòng)泵的流量以減小補(bǔ)料速率．

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 堿性蛋白酶活力的測(cè)定

采用GB/T 23527—2009[16]方法，在40,℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1,μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位．

1.3.2 發(fā)酵液殘?zhí)琴|(zhì)量濃度測(cè)定

采用DNS法[17]測(cè)定殘?zhí)琴|(zhì)量濃度．

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 種齡的確定

種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖1所示．當(dāng)種齡為12,h時(shí)，堿性蛋白酶活力最高，因此確定種齡為12,h．

2.1.2 初始pH的確定

培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖2所示．初始pH為6.0～7.0時(shí)，有利于菌體產(chǎn)酶，初始pH為6.5時(shí)，堿性蛋白酶活力最高，當(dāng)初始pH超過7.0時(shí)，酶活力開始下降．因此，確定培養(yǎng)基初始pH為

6.5．這一結(jié)果與黃文晶[18]、孫同毅等[19]在堿性蛋白酶的優(yōu)化工藝中確定的pH為6.5～7.0一致，說明在此pH能夠穩(wěn)定地維持菌體的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶．

2.1.3 接種量的確定

接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖3所示．當(dāng)接種量為8%時(shí)，堿性蛋白酶活力最高，達(dá)到5,003,U/mL．因此，確定接種量為8%．當(dāng)接種量過小時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵遲緩；接種量過大，則會(huì)因菌體生長(zhǎng)過快而導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)和氧氣缺乏，有些初級(jí)代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生對(duì)酶合成有抑制作用．

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖4所示．

溫度從25,℃升高到34,℃時(shí)，堿性蛋白酶活力逐漸升高，增加趨勢(shì)明顯，34,℃時(shí)酶活力最大，溫度繼續(xù)升高，酶活力開始逐漸下降．因此，確定發(fā)酵溫度為34,℃．若溫度過低，菌體生長(zhǎng)緩慢，會(huì)因菌體量少而影響酶的分泌；溫度過高，菌體代謝加快，指數(shù)期和穩(wěn)定期會(huì)因此而縮短，使衰亡期提早出現(xiàn)．另外，在高溫下酶的熱穩(wěn)定性差，易變性失活．

2.2 地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843在發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵進(jìn)程

地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843在三角瓶中發(fā)酵進(jìn)程如圖5所示．糖分在發(fā)酵初期緩慢消耗，8,h后質(zhì)量濃度迅速下降，可能是菌體大量生長(zhǎng)消耗了發(fā)酵液中的糖分；在24,h時(shí)的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度下降為13.6,g/L，之后糖的消耗速率減慢．因此，確定24,h為補(bǔ)糖時(shí)間點(diǎn)．在前24,h發(fā)酵液中酶活力較低，隨后，發(fā)酵液中的酶活力迅速升高，至64,h時(shí)，酶活力達(dá)到峰值，為5,297,U/mL．

2.3 補(bǔ)料量對(duì)產(chǎn)酶的影響

根據(jù)木糖母液在發(fā)酵過程中的消耗情況，在24,h時(shí)向搖瓶中補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的木糖母液補(bǔ)料液，補(bǔ)料量對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖6所示．

在考察的補(bǔ)料量范圍內(nèi)，補(bǔ)料量為4,mL時(shí)的酶活力峰值最大，為7,838,U/mL，相比于同一批次未補(bǔ)

加木糖母液時(shí)的酶活力峰值(5,137,U/mL)提高了52.5%．可以看出，選擇合適的補(bǔ)料時(shí)機(jī)和補(bǔ)料量，即在發(fā)酵液中的殘?zhí)窍拇M時(shí)及時(shí)補(bǔ)加適量的木糖母液，能夠較好地維持菌體的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶，而又不會(huì)因糖濃度過高而對(duì)產(chǎn)酶產(chǎn)生抑制作用．

2.4 殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料發(fā)酵過程分析

殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果如圖7所示．發(fā)酵液中的糖分在8,h內(nèi)消耗緩慢，此時(shí)菌體處于延滯期，代謝速率緩慢；8,h后糖分的消耗速率開始加快，24,h時(shí)發(fā)酵液中糖分無法繼續(xù)消耗，開啟蠕動(dòng)泵開始反饋補(bǔ)料，在24～48,h補(bǔ)料時(shí)間內(nèi)，補(bǔ)入的糖被及時(shí)消耗，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度未出現(xiàn)大的波動(dòng)；在48,h時(shí)補(bǔ)料結(jié)束，此時(shí)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為13.1,g/L，殘?zhí)菐缀跸拇M；發(fā)酵液酶活力24,h后開始迅速上升，在80,h時(shí)達(dá)到峰值，為14,912,U/mL．可見，殘?zhí)欠答佈a(bǔ)料的方式消除了底物抑制作用對(duì)發(fā)酵過程的影響，且能更好地與菌體的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶條件相吻合，有利于提高酶活力．

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)以木糖母液為碳源、利用地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)工藝：種齡12,h，初始pH,6.5，接種量8%，發(fā)酵溫度34,℃，24,h補(bǔ)加4.0,mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的木糖母液．利用7,L發(fā)酵罐進(jìn)行反饋補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，酶活力在80,h時(shí)達(dá)最大值，為14,912,U/mL．雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前堿性蛋白酶的工業(yè)生產(chǎn)水平尚有一定差距，但木糖母液價(jià)格低廉，有一定的成本優(yōu)勢(shì)，并且還可對(duì)其進(jìn)行更大規(guī)模發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)酶水平．

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責(zé)任編輯：常濤

Alkaline Protease Fermentation Process Using Xylose Mother Liquor

BU Lingjun，LI Yu，LU Fuping，WANG Zhengxiang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

In this study，engineeredBacillus licheniformisTCCC11843,was used for the fermentation production of alkaline protease from a carbon source：xylose mother liquor，a by-product of xylose production. The optimized fermentation parameters of alkaline protease production were：inoculum culture age was 12,h，initial pH 6.5，inoculum volume 8%，fermentation temperature 34,℃，and feeding 4.0,mL 50% xylose mother liquor at the 24th,h. Under such optimal fermentation conditions，the maximum enzyme activity can reach 7,838,U/mL. Moreover，feedback feeding experiments using the 7,L fermenter resulted in the maximum enzyme activity of 14,912,U/mL at 80,h. These results are valuable for the optimal commercial production of alkaline protease.

xylose mother liquor；Bacillus licheniformis；alkaline protease；fed-batch fermentation

Q814.4

A

1672-6510(2014)06-0032-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.007

2014–05–04；

2014–07–01

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”資助項(xiàng)目(2011AA100905-4)；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(IRT1166)

卜令軍（1988—），男，山東濟(jì)南人，碩士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.