湯 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

一種與膽固醇7，8位脫氫相關(guān)蛋白的表達(dá)研究

湯 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

家蠶(Bombyx mori)的Nvd-Bm蛋白是一種與膽固醇7，8–脫氫酶相關(guān)的蛋白．根據(jù)NCBI中報道的家蠶中的膽固醇7，8–脫氫酶基因序列(GenBank登錄號：AB232986.1)，采用密碼子優(yōu)化及基因克隆技術(shù)，擴增獲得膽固醇7，8–脫氫酶目標(biāo)基因nvd-Bm，并構(gòu)建了重組穿梭載體pPIC9K-nvd-Bm，通過電轉(zhuǎn)化，成功構(gòu)建了含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115異源真核表達(dá)工程菌株．經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳分析表明，含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母GS115表達(dá)菌株能夠成功表達(dá)目標(biāo)蛋白，為膽固醇的7，8–脫氫產(chǎn)物即7–脫氫膽固醇的生物轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)．關(guān)鍵詞：家蠶；膽固醇7，8–脫氫酶；密碼子優(yōu)化；畢赤酵母；誘導(dǎo)表達(dá)

維生素D是一種作用于鈣、磷代謝的維生素[1]，它能夠維持人及其他動物體內(nèi)的血磷和血鈣的平衡，促進骨質(zhì)鈣化以及腸道對鈣磷等元素的吸收[2]．其中最重要的是維生素D2(麥角骨化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)．維生素D3在維生素D生物代謝中活性最高，主要由高級動物的表皮和真皮內(nèi)含有的7–脫氫膽固醇經(jīng)紫外線(波長265～228,nm)照射轉(zhuǎn)變而成，也可來自如肝類、魚肝油等動物組織中[3–5]．而7–脫氫膽醇主要由膽固醇經(jīng)膽固醇7，8–脫氫酶作用轉(zhuǎn)變生成，膽固醇7，8–脫氫酶是合成維生素D3的重要生物催化劑．

膽固醇7，8–脫氫酶主要參與蛻皮動物類固醇生物合成過程第一步重要反應(yīng)，其主要功能是催化膽固醇轉(zhuǎn)化為7–脫氫膽固醇．目前膽固醇7，8–脫氫酶在分子水平上的作用機制尚不清楚[6]．Yoshiyama等[7]發(fā)現(xiàn)，家蠶前胸腺中的neverland基因(nvd-Bm)與7，8–脫氫酶相關(guān)．通過RNA干擾和基因敲除技術(shù)獲得的nvd-Bm缺失家蠶幼蟲，其體內(nèi)蛻皮激素的產(chǎn)生量明顯降低而影響其生長，這一干擾可以通過補充7–脫氫膽固醇解除．夏小斌等[8]及Capyk等[9]在秀麗隱

桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)了功能類似的基因daf-36(GenBank登錄號：NM_073228.4)，并證明該酶屬于Rieske非血紅素鐵加氧酶，包含一段Rieske[2Fe-2S]區(qū)域以及一段非亞鐵血紅素關(guān)聯(lián)區(qū)，可催化膽固醇轉(zhuǎn)化為7–脫氫膽固醇，表明nvd-Bm基因具有編碼膽固醇7，8–脫氫酶的作用．

目前，黃時海等[10]實現(xiàn)了基因nvd-Dm在大腸桿菌中的少量表達(dá)，表達(dá)效率偏低．本研究主要克隆了來自家蠶的nvd-Bm基因(GenBank登錄號：AB232986.1)，采用密碼子優(yōu)化技術(shù)，構(gòu)建了nvd-Bm基因的真核表達(dá)工程菌并實現(xiàn)了重組Nvd-Bm蛋白的高效表達(dá)．研究結(jié)果為進一步進行其與伴侶蛋白的共表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115及pPIC9K載體均由本實驗室保存；優(yōu)化后的nvd-Bm基因及5’AOX1 / 3’AOX1引物，由金唯智公司合成．

引物5’AOX1的序列為：5′-GACTGGTTCCAAT TGACAAGC-3′；引物3’AOX1的序列為：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′．

1.2 培養(yǎng)基、酶及試劑

畢赤酵母GS115培養(yǎng)基的配制方法參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊；大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基[11]．

EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、NotⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、低相對分子質(zhì)量蛋白Marker，大連寶生物公司；T4,DNA連接酶，Promega公司；Taq PCR Master Mix，博邁德公司；酵母提取物、蛋白胨，Oxiod公司；膠回收試劑盒，北京天恩澤基因公司；其他化學(xué)試劑均購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠．

1.3 膽固醇7，8–脫氫酶基因的獲取

通過查閱文獻(xiàn)及NCBI中比對，獲得nvd-Bm基因全序列(GenBank登錄號：AB232986.1)；并利用Vector NTI suite 7.0等分子生物學(xué)軟件，在不改變其蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調(diào)整、不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA二級結(jié)構(gòu)等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛性對該序列進行密碼子改造優(yōu)化[12]．并于目標(biāo)基因nvd-Bm兩側(cè)引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點后，委托金唯智公司進行全基因合成．

1.4 畢赤酵母重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

用EcoRⅠ和NotⅠ將由公司合成并連有目標(biāo)基因的重組克隆載體pUC57-nvd-Bm及畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K進行雙酶切，回收1.3,kbp的片段及pPIC9K骨架，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進行連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選得到重組表達(dá)載體pPIC9K-nvd-Bm，對重組表達(dá)載體進行PCR鑒定及雙酶切鑒定，并將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進行測序驗證．

將篩選得到的重組表達(dá)載體pPIC9K-nvd-Bm經(jīng)BglⅡ線性化，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，電擊條件：1.5,kV、25,μF、200,?．轉(zhuǎn)化菌液分別涂布于含4,g/L G418的YPD平板上，30,℃孵育至抗性克隆出現(xiàn)．

挑取抗性克隆，通過玻璃珠和酚氯仿抽提酵母基因組，以基因組為模板，利用5’AOX1/3’AOX1引物進行PCR篩選成功整合的陽性克隆，挑取陽性克隆菌株于YPD培養(yǎng)基中，30,℃培養(yǎng)20,h后，保存甘油管．

1.5 重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDSPAGE分析

將篩選出的陽性克隆接種于100,mL BMGY中，30,℃、250,r/min生長至A600≈3，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中30,℃培養(yǎng)，以最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇溶液進行誘導(dǎo)表達(dá)．5,d后離心經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液上清液轉(zhuǎn)移至干凈的收集管中，沉淀用裂解緩沖液重懸后通過酸洗玻璃珠渦旋振蕩法進行細(xì)胞破碎．分別取菌體培養(yǎng)液上清液及細(xì)胞破碎上清液，通過SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況．

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇脫氫酶基因nvd-Bm的獲取及分析

來源于家蠶的膽固醇7，8–脫氫酶基因nvd-Bm(GenBank登錄號：AB232986.1)全長為1,362,bp，GC含量為53.3%．依據(jù)表達(dá)宿主畢赤酵母的密碼子偏愛性，進行該基因的密碼子優(yōu)化，改變了其中的335個堿基對，其GC含量由53.3%降低到52.9%，優(yōu)化后的基因序列見圖1．

NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切的質(zhì)粒pUC57-nvd-Bm及pPIC9K的電泳圖如圖2所示．從圖2可以看出：泳道1的1.3,kbp片段、泳道2的9.3,kbp片段，分別與目標(biāo)基因nvd-Bm及pPIC9K預(yù)期結(jié)果相符合，表明已成功獲得目標(biāo)基因片段．

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pPIC9K-nvd-Bm的PCR驗證電泳圖如圖3所示．由圖3可以看出：圖中的1.8,kbp片段，與pPIC9K-nvd-Bm菌液PCR預(yù)期結(jié)果相符合，表明目標(biāo)基因nvd-Bm已成功插入畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中．取圖3中的pPIC9K-nvd-Bm重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖4所示．圖4中均出現(xiàn)了1.3,kbp片段，進一步表明目標(biāo)基因nvd-Bm已成功插入畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中．選取圖4中驗證正確的菌株交由公司進行測序，測序結(jié)果與目標(biāo)基因完全一致，表明重組表達(dá)載體pPIC9K-nvd-Bm構(gòu)建成功．

2.3 轉(zhuǎn)化畢赤酵母重組子的篩選和鑒定

含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌進行基因組PCR驗證，結(jié)果如圖5所示．圖5出現(xiàn)的1.8,kbp片段，與重組畢赤酵母GS115基因組PCR預(yù)期結(jié)果相符，表明目標(biāo)基因nvd-Bm均已成功整合至畢赤酵母GS115基因組中．

2.4 膽固醇7, 8–脫氫酶的表達(dá)

已構(gòu)建的含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，分別收集菌體培養(yǎng)液上清液及沉淀．沉淀經(jīng)細(xì)胞破碎后，將菌體培養(yǎng)液上清液及細(xì)胞破碎上清分別經(jīng)蛋白電泳上樣緩沖液重懸煮沸進行SDS-PAGE分析．結(jié)果如圖6所示．

由圖6可知：第2泳道，即含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌培養(yǎng)液在相對分子質(zhì)量約為6.4× 104的位置存在明顯的特異性條帶，由于轉(zhuǎn)錄翻譯起始于載體自身的起始密碼子，翻譯時會同時將載體上的起始密碼子至目標(biāo)基因的起始密碼子間的一段序列一并翻譯出，而該段氨基酸序列相對分子質(zhì)量約為1.3×104，故表達(dá)的蛋白相對分子質(zhì)量會比實際蛋白相對分子質(zhì)量5.1×104偏大，約為6.4×104，與預(yù)期相對分子質(zhì)量一致；另外，由于在畢赤酵母中表達(dá)的蛋白會受到不同程度的糖基化作用，因而電泳中觀測到的蛋白相對分子質(zhì)量會比目標(biāo)蛋白出現(xiàn)不同程度的偏大．進一步經(jīng)蛋白質(zhì)譜鑒定，證明其蛋白一級序列與目標(biāo)蛋白相符，表明目標(biāo)蛋白得到表達(dá)，表達(dá)量較高．

3 討 論

化學(xué)法合成7–脫氫膽固醇的生產(chǎn)工藝一般需要4步合成反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率為62%左右，反應(yīng)途徑長、副產(chǎn)物多、反應(yīng)條件不易控制[13]．生物轉(zhuǎn)化法具體高效、綠色的特性，使其成為許多化學(xué)藥物和醫(yī)藥中間體化學(xué)合成工藝的替代技術(shù)[14]．

目前雖已有關(guān)于基因nvd-Dm在大腸桿菌中表達(dá)的相關(guān)報道，但由于其未依據(jù)大腸桿菌的偏愛性進行密碼子優(yōu)化，故表達(dá)效率偏低．另外，由于目標(biāo)基因來自于昆蟲細(xì)胞，其轉(zhuǎn)錄翻譯更適合在真核表達(dá)體系中進行．本研究對獲得的膽固醇7，8–脫氫酶基因nvd-Bm(GenBank登錄號：AB232986.1)于畢赤酵母中進行了外源表達(dá)，并依據(jù)畢赤酵母偏愛性進行了密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因與黃時海等[11]于大腸桿菌中進行的外源表達(dá)相比，有效地提高了膽固醇7，8–脫氫酶Nvd-Bm的表達(dá)效率．本研究還構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K-nvd-Bm，并通過電轉(zhuǎn)化方法，構(gòu)建了含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母GS115工程菌，SDSPAGE蛋白電泳分析表明，目標(biāo)蛋白Nvd-Bm均已成功表達(dá)，但均主要存在于胞內(nèi)．下一步工作可通過改造pPIC9K-nvd-Bm重組質(zhì)粒信號肽序列引導(dǎo)目標(biāo)蛋白高效胞外分泌，進一步提高其分泌表達(dá)量．此外，7，8–脫氫酶的基因組成目前尚不清晰，僅獲得其編碼基因表達(dá)蛋白，往往難以表現(xiàn)出酶活性．因此本課題組將進一步研究其與伴侶蛋白的共表達(dá)，為膽固醇7，8–脫氫酶的活性檢測奠定基礎(chǔ)．

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責(zé)任編輯：周建軍

Expression of the Protein Related to Cholesterol 7，8-Dehydrogenation

TANG Rui，SHEN Yanbing，GE Rile，NIU Dandan，WANG Min
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Bombyx moriNvd-Bm protein is associated with cholesterol 7，8-dehydrogenase. Based on DNA sequence encoded cholesterol 7，8-dehydrogenase reported on the NCBI(GenBank：AB232986.1)，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was cloned fromBombyx mori. Through codon optimization，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was obtained and the optimized gene was cloned into a yeast expression vector. Heterologously expressed target gene inP. pastorisGS115 resulted in the creation of engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains. Expression of the target protein in the engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains was demonstrated by SDS-PAGE. This study provided a foundation for the biological synthesis of 7-dehydrocholesterol.

Bombyx mori；cholesterol 7，8-dehydrogenase；codon optimization；Pichia pastoris；induced expression

Q812

A

1672-6510(2014)06-0027-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.006

2014–01–10；

2014–05–08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2011AA02A211)

湯 睿（1989—），女，河北人，碩士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.