聶艷輝 霍博雅 孫會(huì)珍

二黃湯對(duì)哮喘模型大鼠肺組織中TGF-β1及體內(nèi)IL-33的影響

聶艷輝1霍博雅2孫會(huì)珍2

目的 觀察二黃湯對(duì)哮喘模型大鼠肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及體內(nèi)白介素-33(IL-33)的影響。方法50只SD大鼠隨機(jī)均分為正常組、哮喘組、布地奈德組、高劑量二黃湯組（含生藥量68 g/kg）和低劑量二黃湯組（含生藥量17 g/kg）。以卵清白蛋白致敏與激發(fā)建立哮喘大鼠模型，隨后分別用布地奈德、二黃湯干預(yù)治療。肺組織切片HE染色觀察病理變化并檢測(cè)氣道管壁厚度（Wat）及氣道平滑肌厚度（Wam），用免疫組化法檢測(cè)肺組織TGF-β1蛋白的表達(dá)，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-33的含量。結(jié)果所有藥物干預(yù)組較哮喘組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕；布地奈德組、高劑量二黃湯組和低劑量二黃湯組Wat均較哮喘組下降（μm2/μm: 54.99±8.82、52.28±7.61、58.53±7.63 vs 79.50±5.64，P＜0.05）；布地奈德組、高劑量二黃湯組和低劑量二黃湯組Wam均較哮喘組下降（μm2/μm:22.74±2.73、20.63±1.72、21.20±4.50 vs 30.16±1.68，P＜0.05）；與正常組比較，哮喘組BALF、血清中IL-33的濃度增高，經(jīng)藥物干預(yù)后，布地奈德組、高劑量二黃湯組和低劑量二黃湯組低于哮喘組（P＜0.05），但3干預(yù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；哮喘組TGF-β1高于正常組（IOD:12.60±2.25 vs 1.67±0.17），布地奈德組（5.51±2.48）、高劑量二黃湯組（5.22±2.52）和低劑量二黃湯組（6.92±2.18）均低于哮喘組（P＜0.05），3干預(yù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。哮喘大鼠的氣道壁厚度和平滑肌厚度與TGF-β1、IL-33呈正相關(guān)。結(jié)論二黃湯可在一定程度上干預(yù)哮喘大鼠氣道重塑，其作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1和IL-33實(shí)現(xiàn)的。

哮喘；氣道重塑；二黃湯；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；白細(xì)胞介素-33

支氣管哮喘(哮喘)是以氣道高反應(yīng)性和不可逆性氣道重塑為特點(diǎn)的氣道慢性炎癥性疾病[1]。參與哮喘的細(xì)胞因子很多，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)通過(guò)促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖參與氣道重塑,而白細(xì)胞介素-33(IL-33)能夠介導(dǎo)哮喘的氣道炎癥，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的促炎效應(yīng)[2]。中醫(yī)治療哮喘有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。本研究通過(guò)復(fù)制慢性哮喘大鼠模型，觀察二黃湯對(duì)哮喘肺組織中TGF-β1及體內(nèi)IL-33的影響，為哮喘的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑及儀器 6周齡SD大鼠50只，雌雄各25只，體質(zhì)量（160±20）g，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。卵清白蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；布地奈德氣霧劑購(gòu)自阿斯利康公司；TGF-β1多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB試劑盒、IL-33酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；二黃湯由黃芩和黃芪組成，水煎并濃縮成含生藥量68 g/kg和17 g/kg的混懸液。雙目鏡顯微鏡（日本Olympus公司）；JWC-201D超聲霧化器（遼寧鞍山市同信醫(yī)用儀器廠）；XD711酶標(biāo)儀（上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為5組：正常組、哮喘組、布地奈德組、高劑量二黃湯組（68 g/kg）及低劑量二黃湯組(17 g/kg)，每組10只，雌雄各5只。

1.2.2 哮喘動(dòng)物模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn)[3-5]復(fù)制哮喘大鼠模型，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在第1、8天腹腔注射10%的OVA生理鹽水混懸液1 mL[內(nèi)含OVA100 mg、Al(OH)3100 mg]致敏，于實(shí)驗(yàn)第15天始將大鼠置于密閉容器內(nèi)，予1%OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)，1 mL/min，30 min/次，1次/d，在霧化激發(fā)前30 min，高、低劑量二黃湯組分別以質(zhì)量濃度為68 g/ kg、17 g/kg的二黃湯灌胃（2 mL/只）；布地奈德組生理鹽水等體積灌胃及布地奈德0.25 mg/kg霧化吸入；哮喘組、正常組等體積生理鹽水灌胃及霧化。均連續(xù)處理6周。以大鼠呼吸急促、口唇發(fā)紺、點(diǎn)頭呼吸、皮毛無(wú)光澤，肺部有哮鳴音、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為模型建立成功的標(biāo)志。

1.2.3 標(biāo)本采集及處理 各組大鼠均于末次激發(fā)后24 h內(nèi)取材。腹腔麻醉下，心臟穿刺取血，行左側(cè)支氣管肺泡灌洗。將支氣管肺泡灌洗液（BALF）和血液一起離心（3 000 r/ min)10 min后，分別收集上清液置入無(wú)菌EP管儲(chǔ)存于-20℃冰箱。同時(shí)取右肺中下葉肺組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定至少48 h后，進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋、切片、片厚4 μm，用于組織病理學(xué)及免疫組化檢測(cè)。

1.2.4 支氣管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam)的測(cè)定 石蠟切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察病理學(xué)改變。每組隨機(jī)取8張切片，在光鏡下，每張切片選取3個(gè)完整無(wú)斜切的小支氣管橫截面，參照文獻(xiàn)[6]關(guān)于氣道各層的定義，采用Image-propls圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各支氣管基底膜周長(zhǎng)(Pbm)、支氣管總面積(Wat1)、管腔面積(Wat2)、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積(Wam1)、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積(Wam2)，并用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化以消除管徑大小、氣道形態(tài)以及切片方向不同等所造成的差別,即以(Watl-Wat2)/Pbm和(Waml-Wam2)/Pbm來(lái)表示W(wǎng)at和Wam。

1.2.5 血清及BALF中IL-33濃度的測(cè)定 應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清及BLAF中IL-33的濃度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行，根據(jù)系列稀釋的12 pg/L、8 pg/L、4 pg/L、2 pg/L、1 pg/L標(biāo)準(zhǔn)品濃度，應(yīng)用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD）值，并計(jì)算出IL-33的濃度值。

1.2.6 免疫組化測(cè)定TGF-β1蛋白表達(dá)水平 采用SABC法按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定TGF-β1表達(dá)水平，用高壓熱抗原修復(fù)，各組分別滴加1∶400的一抗，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，其余條件相同。染色判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性為不著色，弱陽(yáng)性呈淡黃色，陽(yáng)性呈黃色，強(qiáng)陽(yáng)性呈棕黃色和棕色。每張切片任意選擇3個(gè)高倍鏡下(×400)支氣管視野，分別以選定氣管為中心，應(yīng)用Image-propls圖像分析軟件測(cè)定整張切片陽(yáng)性部位的平均吸光度（IOD）用以代表陽(yáng)性部位的蛋白表達(dá)水平，每組計(jì)算24個(gè)IOD值的平均值作為該組的IOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

由于造模死亡及取材失敗，每組取8只大鼠標(biāo)本檢測(cè)。

2.1 肺組織病理改變 正常組肺組織結(jié)構(gòu)的各級(jí)支氣管上皮組織完整，肺泡間隔及腔內(nèi)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘組氣道上皮細(xì)胞脫落，黏膜下及管周有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主，肺泡腔內(nèi)炎性滲出，氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚、肥大，黏膜下層增寬，黏膜上皮增生，管腔狹窄等。布地奈德組和高、低劑量二黃湯干預(yù)組上述改變較哮喘組明顯減輕，但未完全消失，見圖1。

2.2 各組Wat和Wam結(jié)果比較 哮喘組的Wat和Wam均高于正常組，經(jīng)干預(yù)后，布地奈德組、高劑量二黃湯組、低劑量二黃湯組Wat和Wam均較哮喘組降低，但均高于正常組（均P＜0.05），布地奈德組、高劑量二黃湯組、低劑量二黃湯組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.3 血清及BALF中IL-33含量的比較 哮喘組血清及BALF中IL-33的含量均高于正常組，經(jīng)干預(yù)后，布地奈德組、高劑量二黃湯組、低劑量二黃湯組血清及BALF中IL-33的含量均低于哮喘組，但仍高于正常組（P＜0.05），布地奈德組、高劑量二黃湯組、低劑量二黃湯組BALF中IL-33的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，布地奈德組、高劑量二黃湯組血清中IL-33的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但低劑量二黃湯組血清中IL-33的含量高于布地奈德組（P＜0.05），見表2。

Table 1 Wat and Wam in each group表1 各組Wat和Wam比較 （n=8±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與哮喘組比較，P＜0.05

組別正常組哮喘組布地奈德組高劑量二黃湯組低劑量二黃湯組F Wam(μm2/μm) 14.94±1.87 30.16±1.68a22.74±2.73ab20.63±1.72ab21.20±4.50ab12.64＊＊細(xì)支氣管（支）24 24 24 24 24 Wat(μm2/μm) 37.81±1.25 79.50±5.64a54.99±8.82ab52.28±7.61ab58.53±7.63ab29.41＊＊

2.4 各組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較 哮喘組支氣管上皮細(xì)胞、黏膜下、氣管平滑肌層、成纖維細(xì)胞及炎性細(xì)胞等廣泛表達(dá)TGF-β1，強(qiáng)表達(dá)為棕黃色，對(duì)照組表達(dá)不明顯，見圖2。哮喘組TGF-β1蛋白表達(dá)水平高于正常組，干預(yù)后均低于哮喘組，但仍高于正常組（均P＜0.05），布地奈德組、高劑量二黃湯組、低劑量二黃湯組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.5 相關(guān)性分析 氣道壁厚度、平滑肌厚度與TGF-β1蛋白表達(dá)呈正相（r分別為0.725、0.857，P＜0.01）,與血清和BALF中IL-33的含量也呈正相關(guān)（r分別為0.760、0.751，P＜0.01）。

Table 2 Serum IL-33 concentration,BALF and TGF-β1 expression in lung tissues in each group表2各組血清及BALF中IL-33含量和肺組織中TGF-β1水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與哮喘組比較，c與布地奈德組比較，P＜0.05

組別正常組哮喘組布地奈德組高劑量二黃湯組低劑量二黃湯組F n 8 8 8 8 8 IL-33（pg/L）BALF 1.53±0.27 5.99±0.43a3.02±0.99ab3.22±0.94ab3.70±0.89ab23.18＊＊血清2.95±0.11 6.01±0.69a4.28±0.43ab4.25±0.38ab4.98±0.78abc18.53＊＊TGF-β1（IOD）1.67±0.17 12.60±2.25a5.51±2.48ab5.22±2.52ab6.92±2.18ab44.71＊＊

3 討論

氣道炎癥和氣道重塑是支氣管哮喘的兩個(gè)主要病理特征。氣道炎癥是炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)相互作用的結(jié)果。氣道重塑的特征性病理改變主要表現(xiàn)為氣道平滑肌增生和肥大、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積、上皮下纖維化、基底膜增厚、血管生成和黏液腺體的增生等。兩者的關(guān)系尚有爭(zhēng)議，普遍被接受的是慢性炎癥可能繼發(fā)氣道重塑，而氣道重塑也可能與炎癥同時(shí)被激發(fā)。

氣道平滑肌增厚是氣道重塑的一個(gè)重要特征。在肺組織中，幾乎所有的結(jié)構(gòu)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞都能表達(dá)和分泌TGF-β1，而TGF-β1又可作用于這些細(xì)胞及炎癥介質(zhì)，參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。TGF-β1不僅可以誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖還可以加強(qiáng)其遷移。在血小板生長(zhǎng)因子存在的情況下，TGF-β1可上調(diào)平滑肌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白和金屬蛋白抑制劑的表達(dá)，加強(qiáng)其向上皮組織的遷移而形成新的肌束[1]，進(jìn)而使平滑肌和氣道壁增厚?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究，黃芪、黃芪提取物[7-8]和黃芩及黃芩提取物[9]可干預(yù)哮喘氣道炎癥和氣道重塑。糖皮質(zhì)激素是當(dāng)前控制哮喘最有效的藥物。故本研究以布地奈德作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察黃芩及黃芪組成的復(fù)方二黃湯對(duì)哮喘模型大鼠的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用二黃湯干預(yù)后，哮喘大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度較哮喘模型組顯著下降，但與布地奈德組無(wú)差異，提示二黃湯可在一定程度改善氣道重塑。而對(duì)于TGF-β1在肺組織的表達(dá)，二黃湯組和布地奈德組無(wú)差異，提示二黃湯對(duì)于TGF-β1具有良好的抑制作用，二黃湯可能通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)參與改善氣道重塑，且在這過(guò)程中無(wú)明顯劑量依賴關(guān)系。

氣道炎癥仍是目前哮喘研究的重點(diǎn)。IL-33是近年發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的成員，也是一種新的觸發(fā)炎癥免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子。有報(bào)道IL-33參與Th1/ Th2細(xì)胞炎癥過(guò)程[10]，而Th1/Th2比例失衡是哮喘免疫-炎癥機(jī)制中重要的因素。嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘時(shí)IL-33的主要炎癥細(xì)胞分泌來(lái)源[11]。本研究肺組織病理學(xué)結(jié)果顯示：哮喘組氣道黏膜下及管周有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸性粒細(xì)胞為主，肺泡腔內(nèi)也有炎性滲出，經(jīng)布地奈德和高、低劑量二黃湯干預(yù)后，炎癥反應(yīng)減輕，其途徑可能是通過(guò)降低哮喘大鼠體內(nèi)的IL-33來(lái)實(shí)現(xiàn)，且高、低劑量二黃湯和布地奈德一樣可以降低哮喘模型大鼠血清和BLAF中IL-33的含量，療效無(wú)差異，無(wú)明顯劑量依賴關(guān)系。相關(guān)性分析結(jié)果顯示氣道壁厚度、平滑肌厚度與TGF-β1蛋白表達(dá)及IL-33呈正相關(guān)，提示二黃湯抑制哮喘氣道重塑可能與其抑制慢性氣道炎癥密切相關(guān)，抑制氣道炎癥可能有利于改善氣道重塑。

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(2013-09-11收稿 2013-11-12修回)

（本文編輯 閆娟）

The Effect of Erhuang Decoction on Transforming Growth Factor-β1of Lung Tissues and the Expression of Leukotriene-33 in Asthmatic Rats

NIE Yanhui1,HUO Boya2,SUN Huizhen2
1Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2 The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University

Objective To investigate the effect of Erhuang decoction on TGF-β1expression of lung tiusses and the concentrations of IL-33 in asthmatic rats.MethodsFifty Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups equally:Control group,Asthmatic group,Budesonide aerosol group,High-dose Erhuang decoction group(68 g/kg)and Lowdose Erhuang decoction group(17 g/kg).The model of asthma was established by ovalbumin(OVA)sensitizing and challenging.Then Erhuang decoction and budesonide aerosol was used respectively for intervention therapy.Histologic HE staining were used to observe the general pathologic alteration and to analyze the total bronchial wall area(Wat)and the muscle wall area(Wam).The protein expressions of TGF-β1in the lung tissues were detected by immunohistochemistry.The concentrations serum IL-33 and BALF were tested by sandwich ELISA.ResultsThere was significant reduction in the infiltrated inflammatory cells in all drug intervention groups compared with asthma group;The Wat and Wam in asthmatic group was significantly higher in than those in Budesonide aerosol group，High-dose Erhuang decoction group and Low-dose Erhuang decoction group(Wat μm2/μm:54.99±8.82,52.28±7.61,58.53±7.63 vs 79.50±5.64,P＜0.05;Wam μm2/μm:22.74±2.73, 20.63±1.72,21.20±4.50 vs 30.16±1.68,P＜0.05);Compared with control group,BALF and serum IL-33 concentration were significantly higher in asthmatic group.Compared with asthmatic group,all the indicators were significantly decrease in the treatment groups after drug intervention(P＜0.05).Andthere was no significant difference between the treatment groups in all the indicators.TGF-β1expression in lung tissues in asthmatic group were significantly higher than that in control group (12.60±2.25 vs 1.67±0.17).Compared with asthmatic group,there was significantly reduction of TGF-β1expression in the Budesonide aerosol group(5.51±2.48),High-dose Erhuang decoction group(5.22±2.52)and Low-dose Erhuang decoction group(6.92±2.18)(P＜0.05).There were no significant difference between the treatment groups.TGF-β1expression and serum IL-33 concentration in asthmatic rats were positively correlated with Wat and Wam.ConclusionThe effects of Erhuang decotion on ameliorating the progression of airway remodeling about asthmatic rats may be partially by regulating TGF-β1 and IL-33.

asthma;airway remodeling;erhuang decoction;transforming growth factor-β1;leukotriene-3

R562.25,R285

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.014

1遼寧錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院（郵編121000）；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科