姚家喜 錢 彪 王勤章 丁國富 李應龍 李 強 倪 釗 王新敏 王江平 王文曉

蜀葵根預防和治療大鼠腎草酸鈣結石的效果評價及機制初探*

姚家喜 錢 彪 王勤章△丁國富 李應龍 李 強 倪 釗 王新敏 王江平 王文曉

目的 評價蜀葵根預防及治療大鼠腎草酸鈣結石的效果，并初步探討其機制。方法將60只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組，模型組，蜀葵根低劑量預防組、高劑量預防組、低劑量治療組、高劑量治療組。對照組給予自由進食水，模型組給予1%乙二醇自由飲水及進食，預防組每天給予1%乙二醇飲水及蜀葵根提取物灌胃（低劑量250 mg/kg，高劑量500 mg/kg），治療組開始給予1%乙二醇飲水，第15天開始添加蜀葵根提取物（低劑量250 mg/kg，高劑量500 mg/kg）。實驗結束時，利用大鼠尿液、血液及腎臟勻漿標本，檢測大鼠尿量、鈣、磷、鎂、尿素、草酸、血肌酐及腎臟勻漿參數(shù)。顯微鏡下觀察腎組織切片中草酸鈣結晶沉積及病理變化。結果與對照組相比，模型組大鼠尿量、血肌酐、血尿素氮、尿草酸、尿鈣、腎臟勻漿丙二醛（MDA）及腎組織內草酸鈣結晶評分明顯升高（P＜0.05），腎臟勻漿谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）含量明顯下降（P＜0.05）。與模型組比較，預防組、治療組大鼠血肌酐、血尿素氮、尿草酸、尿鈣、腎臟勻漿MDA含量及腎組織內結晶評分明顯下降（P＜0.05），腎組織勻漿GSH、SOD含量明顯升高（P＜0.05）。腎組織病理學顯示蜀葵根提取物預防組及治療組大鼠腎內草酸鈣結晶沉積較模型組明顯減少，腎組織損傷較模型組明顯減輕。結論蜀葵根可以有效預防和治療大鼠腎草酸鈣結石，保護腎功能。

蜀葵屬；草酸鈣；腎結石；蜀葵根

腎結石由于發(fā)病率及復發(fā)率較高，已經(jīng)成為困擾患者生活的嚴重問題，其具體發(fā)病原因不明，目前主要治療方法為手術治療[1]。蜀葵又名一丈紅，是一種具有多種藥用價值的植物，原產(chǎn)我國西南地區(qū)，在全國各地廣泛栽培。蜀葵以根、葉、花、種子入藥，清熱解毒、利尿。蜀葵花也是維吾爾、蒙古等少數(shù)民族常用中草藥?！侗静菥V目》記載：其花氣味甘、寒、滑、無毒，主治小便淋瀝及催生。蜀葵還廣泛生長于南歐和亞洲，藥理學報道其有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛作用[2]，是伊朗治療疾病的傳統(tǒng)醫(yī)藥，但其體內預防及治療腎結石的作用尚少見研究報道，本文旨在通過構建大鼠腎結石模型，研究蜀葵治療腎結石的效果、安全性及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠60只，清潔級，體質量（220±20）g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20±2)℃，相對濕度(50±5)%，光照周期12 h/12 h，自由飲水和標準實驗室飲食。

1.1.2 實驗試劑及儀器 蜀葵根提取物（陜西龍孚生物化工有限責任公司），乙二醇（天津市富宇精細化工有限公司），硝酸銀（北京索萊寶科技有限公司），光學顯微鏡、全自動生化分析儀（日本Olympus公司），LEICA石蠟切片機、LEICA雙目顯微鏡（德國LEICA公司），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型制備 采用隨機數(shù)字表法將實驗大鼠分為對照組、模型組、低劑量預防組、高劑量預防組、低劑量治療組、高劑量治療組，每組10只。以蒸餾水為溶劑配置蜀葵根提取物混懸液灌胃，對照組自由進食水，模型組給予1%乙二醇自由飲水[3]，低劑量預防組給予1%乙二醇自由飲水及蜀葵根提取物250 mg/（kg·d）灌胃，高劑量預防組給予1%乙二醇自由飲水及蜀葵根提取物500 mg/（kg·d）灌胃，低劑量治療組給予1%乙二醇自由飲水并在第15天時給予蜀葵根提取物250 mg（/kg·d）灌胃直至實驗結束，高劑量治療組給予1%乙二醇自由飲水并在第15天時給予蜀葵根提取物500 mg（/kg·d）灌胃，直至第28天實驗結束。每隔1 d稱量大鼠體質量，同時觀察實驗大鼠的一般狀況。

1.2.2 指標檢測 大鼠代謝籠收集大鼠24 h尿液，檢測24 h尿量、尿pH值、Ca2+、Mg2+、尿草酸含量。第28天大鼠麻醉后心臟取血，全自動生化分析儀檢測血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、P、Ca2+、Mg2+含量。取血后處死大鼠，切取雙腎，于冰冷的生理鹽水中迅速清洗，吸干表面水分。右側腎臟置于0.02 mol/L的pH值為7.4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液10 mL中勻漿，按照試劑盒說明檢測腎臟SOD、GSH、MDA含量。左側腎臟用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做常規(guī)HE染色切片和礦化結節(jié)（Von kossa）染色切片，光學顯微鏡下觀察腎組織草酸鈣結晶形態(tài)、分布及腎組織病理改變，并在10倍鏡視野下對結晶數(shù)量進行評分[4]，無結晶計0分，1～10個結晶計1分，11～30個結晶計2分，31～50個結晶計3分，51～75個結晶計4分，多于75個結晶計5分。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蜀葵根提取物對大鼠一般情況的影響 實驗過程中無大鼠死亡，實驗中觀察到模型組大鼠毛色無光澤，雜亂，精神萎靡，畏寒、不思飲食。對照組大鼠體形豐滿，精神狀況良好，飲食活動正常。實驗組（高低劑量預防及治療組）一般狀況介于兩者之間。

2.2 蜀葵根提取物對大鼠尿量及尿生化指標的影響 模型組大鼠24 h尿量明顯高于對照組，蜀葵根預防組、治療組24 h尿量明顯高于對照組和模型組（P＜0.05）。模型組、預防組及治療組的尿草酸高于對照組，預防組及高劑量治療組尿草酸低于模型組（P＜0.05）。模型組、低劑量預防組、低劑量治療組24 h尿Ca2+明顯高于對照組，高劑量預防、高劑量治療組24 h尿Ca2+明顯低于模型組（P＜0.05）。各組24 h尿pH值及Mg2+差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

Table 1 Effect of Alcea rosea roots on urinary parameters in wistar rats with urolithiasis表1 蜀葵根提取物對各組大鼠尿液指標的影響 （n=10±s）

＊P＜0.05,a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組低劑量預防組高劑量預防組低劑量治療組高劑量治療組F 24 h尿量（mL/24 h）13.82±3.52 20.24±3.27a25.68±1.06ab35.36±2.27ab28.00±3.70ab30.14±3.94ab103.983＊pH值6.00±0.01 5.60±0.22 6.00±0.72 5.60±0.22 5.70±0.25 6.00±0.01 4.429草酸（μmol/24 h）37.08±13.40 121.49±29.19a85.33±5.90ab61.47±7.55ab108.91±7.81a95.28±6.25ab94.365＊Ca2+（μmol/24 h）7.61±1.72 17.71±2.04a12.89±0.06a8.31±0.55b14.68±0.41a10.93±0.30b30.809＊Mg2+（μmol/24 h）28.95±1.27 24.77±1.16 28.52±5.16 25.12±2.06 23.60±5.92 28.87±5.96 11.384

2.3 蜀葵根提取物對大鼠血生化指標的影響 模型組大鼠血BUN、Cr水平明顯高于對照組（P＜0.05），與模型組比較，蜀葵根預防組和治療組血BUN、Cr水平明顯下降（P＜0.05）。各組大鼠血P、Ca2+、Mg2+含量差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

2.4 蜀葵根提取物對大鼠腎臟指標的影響 模型組大鼠腎臟GSH、SOD含量低于對照組，蜀葵根預防組、治療組GSH、SOD含量與模型組相比明顯升高（均P＜0.05）。模型組大鼠腎臟MDA含量高于對照組，蜀葵根高劑量預防組、高劑量治療組MDA含量與模型組相比明顯下降（P＜0.05）。蜀葵根預防組、治療組腎臟草酸鈣結晶評分明顯高于對照組，低于模型組（P＜0.05），見表3。

2.5 蜀葵根提取物對大鼠腎臟組織草酸鈣沉積的影響 肉眼觀察，對照組大鼠腎臟大小、色澤正常，觸之柔軟。模型組大鼠腎臟皮質、髓質分界不清，用手觸摸有明顯的磨砂感，光學顯微鏡下觀察，HE染色切片的草酸鈣晶體為淡灰色至白色透明狀晶體，見圖1；礦化結節(jié)染色切片的草酸鈣晶體呈黑色，見圖2。組織病理學分析顯示，對照組腎組織無明顯病理變化及草酸鈣晶體沉積。模型組大鼠腎組織內有大量草酸鈣晶體形成，主要存在于腎髓質內，腎乳頭及腎皮質亦有草酸鈣晶體沉積，腎小管上皮細胞明顯腫脹、變性、壞死，管腔明顯擴張，管腔內可見草酸鈣晶體沉積及脫落的上皮細胞；腎間質可見到明顯的慢性間質性炎癥。與模型組比較，蜀葵根預防組、治療組大鼠腎組織內草酸鈣晶體沉積明顯減少，腎小體結構破壞減輕，腎小管管腔擴張程度較輕，管腔內無明顯的壞死脫落樣的物質，病理損傷減輕。

Table 2 Effect of Alcea rosea roots on serum parameters in wistar rats with urolithiasis表2 蜀葵根提取物對各組大鼠血液指標的影響 （n=10±s）

＊P＜0.05,a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組低劑量預防組高劑量預防組低劑量治療組高劑量治療組F BUN（mmol/L）7.99±0.49 28.24±5.62a12.08±0.51ab9.48±0.16b15.83±1.03ab10.98±0.17b189.137＊Cr（μmol/L）54.54±11.22 156.84±26.04a99.56±1.98ab68.16±5.71b120.94±6.57ab114.08±1.55ab240.583＊P（mmol/L）2.50±0.20 2.62±0.18 2.72±0.19 2.68±0.13 2.88±0.49 2.65±0.25 20.062 Ca2+（mmol/L）2.58±0.10 2.64±0.25 2.65±0.08 2.62±0.02 2.66±0.05 2.56±0.06 5.795 Mg2+（mmol/L）0.86±0.09 0.88±0.08 0.95±0.12 0.88±0.12 1.00±0.44 0.86±0.05 11.382

Table 3 Effect of Alcea rosea roots on kidney parameters in wistar rats with urolithiasis表3 蜀葵根提取物對各組大鼠腎臟勻漿指標的影響 （n=10±s）

＊P＜0.05,a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組低劑量預防組高劑量預防組低劑量治療組高劑量治療組F GSH（μmol/g蛋白）908.83±123.93 485.61±122.58a601.27±140.97ab856.99±120.60b728.76±111.29ab785.57±125.23ab73.232＊SOD（U/mg蛋白）3.58±0.28 1.56±0.22a2.55±0.57b2.97±0.41b2.14±0.23ab2.50±0.37b409.119＊MDA（nmol/mg蛋白）62.95±12.24 189.31±14.86a132.98±44.96a84.96±33.47b179.24±62.29a102.53±19.77b221.711＊結晶評分0 5.00±0.12a3.12±0.32ab1.18±0.14ab3.74±0.26ab2.80±0.15ab541.793＊

3 討論

泌尿系結石產(chǎn)生是由于體內促進結石和抑制結石的條件失衡所致，結石的主要成分是草酸鈣。文獻報道表明，乙二醇誘導的雄性大鼠腎結石主要成分是草酸鈣結石，形成原因是乙二醇導致體內草酸的排泄及草酸在尿液的濃度升高[5]。本研究結果發(fā)現(xiàn)蜀葵根提取物可以顯著降低草酸排泄，但其作用機制仍不清楚，可能與下列因素有關。（1）高草酸尿是草酸鈣結石形成的主要因素[6]，蜀葵根高劑量預防組及高劑量治療組的尿液草酸及Ca2+含量明顯低于模型組，說明蜀葵根可能抑制大鼠體內草酸形成，并降低尿鈣濃度，從而抑制草酸鈣結晶的形成。蜀葵根具有利尿作用，有利于草酸鈣結晶的排出，減少結晶在腎臟的滯留。（2）已有研究報道表明蜀葵根具有抗炎及抗氧化作用[7-8]。本實驗結果表明，蜀葵根給藥之后，與模型組比較血BUN、Cr水平明顯下降，表明蜀葵根可以保護腎功能，減輕腎臟損傷。蜀葵根預防組、治療組腎臟GSH、SOD活性明顯高于模型組，高劑量預防及治療組的MDA活性低于模型組，說明蜀葵根可明顯抑制草酸導致的腎臟脂質過氧化反應，清除氧自由基。而脂質過氧化反應產(chǎn)生活性氧，導致腎上皮細胞的損傷，形成細胞碎片，利于結晶黏附于腎小管內成核聚集。因此，蜀葵根提取物其內部化學成分的抗炎和抗氧化作用可以減少結晶在腎臟的滯留且保護腎功能。（3）有報道表明，蜀葵根可以分泌具有黏附作用的黏多糖[9]，因此，蜀葵根提取物可以通過阻礙草酸鈣結晶與腎小管表面的附著位點結合，即在結晶表面形成保護膜阻止其與細胞表面黏附，從而抑制結晶的成核聚集及黏附。也有報道草酸鈣結晶是由于細菌引起的，如納米細菌。Ciftcioglu等[10]對72例腎結石患者進行納米細菌培養(yǎng)和單克隆抗體免疫熒光染色鑒定，其中70例陽性。高文清[11]研究了蜀葵花提取物體外抑制細菌、真菌的活性，發(fā)現(xiàn)蜀葵根提取物也有抗菌作用。Seyyednejad[12]也證實蜀葵根提取物具有抗菌作用。因此不排除其具有抑制納米細菌的作用，可能也是其抗結石的機制之一，但具體論證仍需進一步研究。

組織病理學顯示在模型組大鼠腎小管管腔內有多形態(tài)、不規(guī)則的草酸鈣結晶，伴管腔水腫及細胞脫落，近端小管擴張及間質性炎癥，并有小管間出血及血管充血現(xiàn)象，與文獻報道的現(xiàn)象一致[13]。蜀葵根預防、治療組與模型組比較，不同程度降低了草酸鈣結晶的大小和數(shù)量，減輕了腎小管的出血、水腫及炎癥。表明蜀葵根提取物在一定程度上可以減少結晶的形成及減輕腎臟的損傷。目前的研究證明其在治療腎結石方面是有效的，但是闡明這種效用的機制還需要進一步研究。

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（2013-09-13收稿 2013-10-28修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects and Mechanism of Alcea Rosea Roots in Ethylene Glycol Induced Nephrolithiasis in Rats

YAO Jiaxi,QIAN Biao,WANG Qinzhang,DING Guofu,LI Yinglong,LI Qiang,NI Zhao,WANG Xinmin, WANG Jiangping,WANG Wenxiao
Department of Urology First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Xinjiang 832000,China

ObjectiveTo study the beneficial effect and mechanism of Alcea rosea roots in nephrolithiasis model induced by 1%ethylene glycol in rats.MethodsWe randomly divided 60 male Wistar rats into six groups，including control group,model group,Alcea rosea roots lower-dose preventive group,Alcea rosea roots high-dose preventive group,Alcea rosea roots lower-dose curative group,Alcea rosea roots high-dose curative group.Control group was free to access food and water;model group was given 1%ethylene glycol drinking water and was fed with normal diet,preventive group was given 1%ethylene glycol drink and Alcea rosea roots in low(250 mg/kg)or high dose(500 mg/kg)each day,curative group

1%ethylene glycol drink each day and Alcea rosea roots in low or high dose from day 15 to day 28.At the end of the experiment,various renal functional and injury markers such as urine volume,calcium,phosphate,magnesium,urea,creatinine,and oxalate were evaluated using urine,serum,and kidney homogenates.The kidneys were removed and prepared for histological evaluation of calcium oxalate deposits.ResultsIn model groups,urine output,urea,creatinine,24 h urine Ca2+,and oxalate and MDA were increased compared to those in control group（P＜0.05）.GSH and SOD were increased in preventative and curative groups compared to those in the model group（P＜0.05）.The urea,creatinine,24 h urine Ca2+, urine oxalate,MDA were reduced in preventive and curative groups compared to those in the model group（P＜0.05）.The number and size of calcium oxalate crystal deposits were also less and smaller,and the kidney damage was less severe in preventive and curative groups compared to in the model group.ConclusionThe extract of Alcea rosea roots can prevent and treat calcium oxalate urinary stone formation in rats and protect renal function.

althaea;calcium oxalate;kidney calculi;alcea rosea roots

R692.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.012

*石河子大學優(yōu)秀青年項目（項目編號：2012ZRKXYQ-YD29）

新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科（郵編832000）

△通訊作者 E-mail：wqz1969@sina.com